[发明专利]黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮液相芯片检测试剂盒及其制法

权利要求书

1.一种黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮液相芯片检测试剂盒，其特征是：试剂盒内分别装有缓冲液、黄曲霉毒素B1-BSA和/或玉米赤霉烯酮-BSA偶联微球、生物素标记AFB1多克隆抗体和/或ZEN单克隆抗体、不同浓度倍比稀释AFB1标准品和/或不同浓度倍比稀释ZEN 标准品。

2.根据权利要求1所述的一种黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮液相芯片检测试剂盒，其特征是：所述缓冲液选用：0.1M PBS，pH 7.4或50 mM HEPES，pH 7.4或20 mM MOPS， pH 7.2或50 mM MES，pH 6.5。

3.根据权利要求1所述的一种黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮液相芯片检测试剂盒，其特征是：所述微球选用：Luminex 1-100号羧基化微球。

4.根据权利要求1－3任一所述的一种黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮液相芯片检测试剂盒，其特征是：缓冲液中悬浮有分别偶联黄曲霉毒素B1-BSA和玉米赤霉烯酮-BSA的微球，黄曲霉毒素B1-BSA多抗临界饱和浓度为0-6.0ng/μL；玉米赤霉烯酮-BSA单抗临界饱和浓度为0-2.0μg/mL。

5.一种黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮液相芯片二重检测试剂盒的制法：

第一步微球偶联：偶联操作参照Luminex 偶联操作说明书进行，取28号微球和36号微球各100μL，分别偶联AFB1-BSA和ZEN-BSA各100μg；

偶联质控： 取28号和36号微球各10μL，分别偶联生物素标记兔抗羊IgG各10μg；

A：计算微球得率：取上述悬浮微球，4μL /管，用微球保存液稀释至125μL，采用血球计数板在光学显微镜下进行微球计数；每个离心管取3份样品进行计数，并取其平均值，用该平均值根据计算公式（1）和（2）计算偶联微球得率，偶联微球得率符合Luminex操作要求；

偶联微球数量（个）=（平均值/4）×10⁴×（125/4）×0.1… 公式（1）

偶联微球得率=[偶联微球数量/（6.25×10⁵）]×100%……..  公式（2）

B：检测偶联微球质量：包括空白质控、阴性质控、偶联质控检测，

空白质控：取原始28号和36号微球各10μL，分别加入到1.5 mL离心管中，并用偶联缓冲液稀释至100μL，分别加入微球封闭液， 25μL/管，混匀，37℃避光孵育30min； 

阴性质控：取偶联AFB1-BSA的28号微球以及ZEN-BSA偶联36号微球各10μL，分别加入到1.5 mL离心管中，并用偶联缓冲液稀释至100μL，分别加入4μg/mL SAPE，25μL/管，混匀，37℃避光孵育30min； 

偶联质控：取偶联生物素标记兔抗羊IgG的28号和36号微球各10μL，

分别加入到1.5 mL离心管中，并用偶联缓冲液稀释至100μL，分别加入4μg/mL SAPE，25μL/管，混匀，37℃避光孵育30min；分别取75μl上述30min孵育产物，加入液相芯片系统中进行测试；

判断标准：液相芯片偶联实验结果应同时满足以下三个条件：1）空白质控MFI低于50；2）阴性质控MFI低于100；3）偶联质控MFI要求高于1000，并远大于Cutoff值，偶联微球质量符合质量判断标准，备用；

第二步标记抗体生物素：

严格按照Pierce生物素标记试剂盒(EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit)操作说明书进行，质量控制要求，

A500H/A≈0.9-1.3；

A500H/A/B≈2.0-3.0；

抗体生物素标记符合EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit质量标准，备用；

第三步确定抗体临界饱和浓度：

在1.5mL的离心管中按表3依次加入36#100偶联微球、28#100偶联微球、生物素标记ZEN单克隆抗体、生物素标记AFB1多克隆抗体，最后用PBS补足体积至100μL；每个反应体系重复配制3个；混匀，避光37℃孵育24h；配制4μg/mL SA-PE；向每个离心管里加25μL 4μg/mL SA-PE；混匀，37℃避光孵育30min；取上述反应液，75μl/反应体系，加入液相芯片中测试；用EXCEL软件对实验结果求平均值，并将抗体浓度和其对应的荧光信号值绘制散点图，根据散点图呈现趋势，选取线性关系较好的点进行直线拟合，求其R²，最R²对应的抗体浓度即为临界饱和浓度。