[发明专利]检测CW9基因中的CpG甲基化片段的方法

权利要求书

1.一种检测CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其特征在于：该方法通过单克隆抗体和化学发光试剂联用的方法进行检测CW9基因中的CpG甲基化片段。

2.根据权利要求1所述的检测CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其特征在于：单克隆抗体和化学发光试剂联用的方法的具体步骤如下：

（1）、制备单克隆抗体：

单克隆抗体利用下列试剂:

抗原： CW9基因CpG岛甲基化片段为阳性抗原，CW9基因CpG岛非甲基化片段为阴性抗原，非特异性抗原为：MGMT基因CpG岛甲基化片段，P16基因CpG岛甲基化片段，HPP1基因CpG岛甲基化片段；

其它特殊试剂：弗氏完全佐计与弗氏不完全佐计，L-谷氨酰胺聚乙二醇-1000，14-四甲基15烷，邻苯二胺，TRIS，HEPES缓冲剂，辣根过氧化氢酶标兔抗BALB/c鼠检验试剂盒其他常规化学试剂均为分析纯试剂；

免疫动物: 8周龄BALB/c雄性小鼠用阳性抗原甲基化CW9/CpG进行二次免疫；每只小鼠基础免疫剂量为100μg，腹腔注射；24d后加强免疫，剂量为每只小鼠100μg，尾静脉注射，4d后取脾融合；

细胞融合：免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp-2 / 0以10:1混合；用50%分子量为1000聚乙二醇作融合剂，融合细胞用含20%小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5%CO2，37℃条件下培养，7d后，每培养孔更换2/3HT培养液；9d后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆化；

腹水抗体纯化：用硫酸铵盐析法纯化腹水抗体；

（2）、CW9甲基化片段免疫化学发光法测定：

a. 化学发光系统的优化由SapphireII不同浓度的增强剂和成底物工作液，进行化学发光值测定，进行底物工作液的优化；

b.固相化抗体微孔板的制备：将上述制备的抗CW9甲基化片段单克隆抗体用0.05 mol/L、pH为 9.6的碳酸盐缓冲液稀释成1.0, 2.0, 5.0, 7.0, 10.0, 15.0 μg/mL的包被浓度，按100 μL/孔的量加入包被板中，37℃包被2 h，再用含10 g/L酪蛋白的0.01 mol/L、 pH为 7.4的PBS 37℃封闭2 h后晾干备用，确定包被选择最佳包被抗体工作浓度；

c.以正常人游离DNA作为参考，确定用优化好的HRP化学发光定量试剂对100份健康人标本进行浓度测定，进行统计学分析，确定正常游离DNA, CW9甲基化片段参考范围；

d.化学发光免疫检测样品或标准品于相应孔分别加25 μL后，每孔再各加第二抗体75 μL，在震荡器上混匀1 min，置37℃恒温反应60 min. 洗掉游离成分，加入底物工作液50 μL，催化底物，第10 min后测定各加样品孔的发光值RLU，并将数据用化学发光检测仪定量软件Luminoskan Ascent version 2.4.1软件进行定量分析。

3.根据权利要求2所述的检测CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其特征在于：将制备的单克隆抗体进行杂交瘤筛选及抗体检测，具体步骤如下：

杂交瘤筛选用固相抗原间接竞争性ELISA法进行：包被阳性抗原：甲基化CW9/CpG的浓度为25μg/ml，每孔加量150μl；每孔所含抗体抗原反应物由80μl培养上清液+2μl经紫外分光光度计标定浓度的15μg/ml的甲基化CW9/CpG组成；检测对照孔中的抗原部分则用20μl、20%MeOH-PBS的抗原稀释液代替；酶底物用邻苯二胺；其它按标准方法进行。