[发明专利]检测CW9基因中的CpG甲基化片段的方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学检验领域，尤其设计一种检测CW9基因中的CpG甲基化片段的方法。 

背景技术

我国肿瘤的诊断主要依靠影像学手段，其缺点是不能早期诊断。一旦发现影像学异常，多数病例已错过手术治疗甚至化学药物和放射治疗的时机。因此，借助免疫检测肿瘤标志物进行早期诊断始终是肿瘤防治研究的重要课题。但现有试剂盒检测结果与疾病的符合率还不理想。对许多病例不能做出准确早期诊断。目前市场上用于免疫检测肿瘤标志物的主要有放射免疫和酶免疫两大类试剂盒。虽然它们都通过定量分析病人体内的肿瘤标志物表现提出诊断信息，但是存在以下几方面的问题： 

a.定量标准混乱，不同厂家生产的试剂盒定量一个特定样品的结果有时会相差数倍，导致特定标志物表达的信息无法准确传递出来，与疾病的符合程度下降；

b.定量范围不合理。普遍表现为定量范围窄，在实际应用中给定量的准确性带来影响。因而，新型检测技术精确定量分析肿瘤标志物，可以准确区别个体分度和疾病状态下肿瘤标志物水平的差异及浓度变化。而化学发光免疫诊断技术由于灵敏度高，线性范围宽，从而在有种于确定合理的定量和定量范围。

结肠镜检查是目前临床使用的最精确的结肠癌筛检方法，但是，高额的费用和患者不愿承受这种侵入性治疗方法限制了它的使用。结肠癌发生时，关联相关基因CW9出现甲基化，然后利用RT-PCR技术进行片段扩增，基因检测，或者而采用其他的方法进行检测，但对于在片段扩增前的基因CW9甲基化的早期检测方法效果并不理想。 

发明内容

发明目的：本发明提供一种检测CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其目的是解决以往的检测方法效果不理想的问题。 

技术方案：本发明是通过以下技术方案来实现的： 

一种检测CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其特征在于：该方法通过单克隆抗体和化学发光试剂联用的方法进行检测CW9基因中的CpG甲基化片段。

单克隆抗体和化学发光试剂联用的方法的具体步骤如下： 

（1）、制备单克隆抗体：

单克隆抗体利用下列试剂:

抗原： CW9基因CpG岛甲基化片段为阳性抗原，CW9基因CpG岛非甲基化片段为阴性抗原，非特异性抗原为：MGMT基因CpG岛甲基化片段，P16基因CpG岛甲基化片段，HPP1基因CpG岛甲基化片段；

其它特殊试剂：弗氏完全佐计与弗氏不完全佐计，L-谷氨酰胺聚乙二醇-1000，14-四甲基15烷，邻苯二胺，TRIS，HEPES缓冲剂，辣根过氧化氢酶标兔抗BALB/c鼠检验试剂盒其他常规化学试剂均为分析纯试剂；

免疫动物: 8周龄BALB/c雄性小鼠用阳性抗原甲基化CW9/CpG进行二次免疫；每只小鼠基础免疫剂量为100μg，腹腔注射；24d后加强免疫，剂量为每只小鼠100μg，尾静脉注射，4d后取脾融合；

细胞融合：免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp-2 / 0以10:1混合。用50%分子量为1000聚乙二醇作融合剂，融合细胞用含20%小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5%CO2，37℃条件下培养，7d后，每培养孔更换2/3HT培养液。9d后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆化；

腹水抗体纯化：用硫酸铵盐析法纯化腹水抗体；

（2）、CW9甲基化片段免疫化学发光法测定：

a. 化学发光系统的优化由SapphireII不同浓度的增强剂和成底物工作液，进行化学发光值测定，进行底物工作液的优化；

b.固相化抗体微孔板的制备：将上述制备的抗CW9甲基化片段单克隆抗体用0.05 mol/L、pH为 9.6的碳酸盐缓冲液稀释成1.0, 2.0, 5.0, 7.0, 10.0, 15.0 μg/mL的包被浓度，按100 μL/孔的量加入包被板中，37℃包被2 h，再用含10 g/L酪蛋白的0.01 mol/L、 pH为 7.4的PBS 37℃封闭2 h后晾干备用，确定包被选择最佳包被抗体工作浓度；

c.以正常人游离DNA作为参考，确定用优化好的HRP化学发光定量试剂对100份健康人标本进行浓度测定，进行统计学分析，确定正常游离DNA, CW9甲基化片段参考范围；