[发明专利]一种评价HER2靶位治疗药物及手段的体外检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种评价HER2靶位治疗药物及手段的体外检测方法。

背景技术

乳腺癌具有高发病率和高致命性，是女性最常见的恶性肿瘤之一。世界范围内，每年约有超过1200万的女性被确诊患有乳腺癌，严重影响着女性的健康生活。目前治疗乳腺癌仍主要依赖放疗和化疗，毒副作用较大，并且特异性差，易产生并发症状。随着乳腺癌发病理论研究的不断深入，研究人员发现乳腺癌其实是某些与细胞增殖相关的原癌基因发生突变所导致的一种复杂分子疾病。而人表皮生长因子受体2(HER2)则是公认的与乳腺癌发病密切相关的原癌基因之一。研究表明，约25％-30％乳腺癌患者的癌细胞存在HER2的过度表达，而它的过量表达能够不断与人表皮生长因子受体家族的其他成员如HER1，HER3形成异源二聚体，通过磷酸化作用激活各种下游信号转导途径如MAPK，P13K/AKT/mTOR等，从而引起一系列的细胞反应包括促血管生成，抗凋亡，促细胞生长等，使癌细胞一直处于失控的持续增殖状态之中。基于此，HER2是研究治疗和诊断乳腺癌的一个最重要的靶分子，而围绕该靶分子所开发出的包括单克隆抗体，激酶抑制剂，反义寡核苷酸等生物治疗药物及手段也因其高效，特异性强和毒副作用较小等特点迅速引起了研究人员的高度重视和大量投入。此外，HER2的高表达在宫颈癌细胞中同样存在，因此该靶点也是研究治疗和诊断宫颈癌的重要突破口之一。

在生物治疗药物及手段的开发过程中，为了便于大量具有生物活性治疗药物及手段的筛选，研究人员需要通过一种快速，高效的检测手段能够准确的评价候选治疗药物及手段的生物活性，效果及其稳定性。这种方法必须满足下列几个条件：首先该法最好是体外实验，基于细胞水平，如增殖抑制，ADCC，CDC等，或基于酶促反应；其次，该方法的实验机理与药物及手段在体内的作用机理应尽可能一致，通过体外实验能够真实的反应该治疗药物及手段在体内作用的疗效，包括在细胞系的选择上也应尽量与真实病患情况接近；第三，该法必须通过方法验证，满足方法专属性，准确性，精密度以及耐用性等方面的要求，如针对同一样品检测的重复性，日间差，人员操作误差等结果的RSD应该满足小于10％。在此基础上，才能保证生物活性检测结果的可靠，并用于指导治疗药物及手段筛选工作。最后，在相同的实验条件下，该方法越简单，操作步骤越少越好，因为这样的方法更加灵活，更有利于推广，并且适用于高通量工作。

以基于靶分子HER2进行生物治疗药物及手段研发为例，关于该原癌基因的作用机制已经逐渐阐明。乳腺癌细胞过量表达HER2，随之通过一系列级联反应，并最终处于失控的持续增殖状态中。根据实验设计作用机理一致性原则，研究人员通常利用该治疗药物及手段对高表达HER2细胞的体外增殖抑制作用来评价其生物活性及效果。常用的高表达HER2的细胞系主要是人乳腺腺癌细胞SK-BR-3和人乳腺导管癌细胞BT-474。然而到目前为止，从文献报道来看，该增殖抑制的细胞学活性方法并未得到公认或标准化，例如细胞系的选择，细胞铺板密度，治疗药物及手段作用时间，显色时间以及显色方式等都各不相同。更重要的是，在已经报道的增殖抑制活性方法中，也缺乏对检测体系专属性，准确性，重复性等方面的相关评价，包括对实验结果的评价方式也存在不同，难以保证检测结果的稳定性与可靠性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对以上存在的问题与不足，提供一种在评价HER2靶位治疗药物及手段过程中，对具有生物活性治疗药物及手段进行筛选以及稳定性评价的细胞增殖抑制生物活性检测方法。该方法能够满足方法验证过程中对专属性，准确性，精密度包括重复性，日间差，人员操作误差，以及耐用性等方面的要求，能够对大量生物活性治疗药物及手段进行快速，准确，高通量的筛选，满足治疗药物及手段在研发过程中的需求。。

为此，本发明公开了一种评价HER2靶位治疗药物及手段的体外检测方法，包括下列步骤：

a 取对数生长期表达HER2的细胞经酶消化后，用完全培养基制成细胞悬液，计数并计算细胞密度及活率，调整至合适的活细胞密度为n×10⁵个/ml，n＝1-3，将细胞悬液等体积加入细胞培养板孔中，同时设立空白对照孔，空白对照孔被加入等体积完全培养基，然后将细胞培养板置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养过夜；

b 取对照品及待测样品，用完全培养基进行系列梯度稀释，得到系列稀释浓度的对照品及待测样品；

c 取步骤a的细胞培养板，除去上清。