[发明专利]山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR鉴别方法

说明书

技术领域

    本发明提供了一种山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR鉴别方法。

背景技术

山羊绒即通常所说的羊绒，是一种珍稀而昂贵的动物纤维。其纤维细度均匀，手感滑糯柔软而细腻，拉力强而富有弹性，素有“软黄金”之称。其羊绒制品具有极高的品质和舒适的服用性能，受到人们的喜爱，价格也很高。生产者为了降低成本，将与山羊绒外观相似的细支绵羊毛或经处理改性的绵羊毛混入织物中，使市场上出现假冒或含量降低的山羊绒纺织品，大大损伤了消费者的利益。因而有效鉴别山羊绒与绵羊毛就显得非常重要。

山羊绒与绵羊毛同属蛋白质纤维，化学性质的差异不大，而仅在鳞片结构及纤维细度上有些差异，目前鉴别方法主要有光学投影显微镜法、溶液法、染色法和扫描电子显微镜法等，但存在误差较大、误判率较高，试样准备繁琐、操作复杂，带有检测者的主观判断，结果欠客观等缺点。山羊绒和绵羊毛的准确、客观鉴别是当前检验工作中迫切需要解决的重要技术难题之一。

近年来，分子生物学检测技术飞速发展，在生物学各个领域已得到广泛应用。由于不同毛类纤维的遗传物质DNA存在差异，因此可利用基于DNA基础上的分子生物学方法（如实时荧光PCR法）来鉴别区分山羊绒和绵羊毛，以达到灵敏、准确、客观的目的。据检索，国外已有采用PCR-RFLP方法来鉴别不同动物毛纤维的报道，但未见有应用其他基于DNA基础上的分子生物学方法（如实时荧光PCR法）的报道。我国虽然是进口羊毛和出口羊绒大国，但是在山羊绒和绵羊毛分子生物学鉴别方法的研究上还是空白。我们首次建立了山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR鉴别方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够灵敏、准确地鉴别山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR方法。

本发明采取的技术方案如下：

本发明的一种山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR鉴别方法，所述方法包括：提取样品DNA；针对山羊、绵羊的线粒体DNA序列设计引物和探针；通过实时荧光PCR，对DNA中的山羊成分、绵羊成分分别进行特异性扩增；根据扩增曲线和Ct值鉴别待测样品中是否含有山羊绒、绵羊毛。

用于鉴别山羊绒的引物、探针为：12SG-F：5’-CGC CCT CCA AAT CAA TAA-3’、12SG-R：5’-CTA TAG TGT ATC AGC TGC A-3’、12SG-P：5’-FAM-AAA CGT GTT AAA GCA CTA CAT C-TAMARA-3’；用于鉴别绵羊毛的引物、探针为：12SS-F：5’-ATA TCA ACC ACA CGA GAG GAG AC-3’、12SS-R：5’-TAA ACT GGA GAG TGG GAG A-3’、12SS-P：5’-FAM-ACT AAT CCT CAT CCT CAT GC-TAMARA-3’。

所述PCR反应体系为：2×Premix Ex Taq^TM 12.5μL，50×ROX Reference Dye Ⅱ0.5 μL，10 μmol/L引物、探针各0.75μL，DNA模板5 μL，ddH₂O 4.75μL；鉴别山羊绒的PCR反应条件为：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，54 ℃，35 s，40个循环；鉴别绵羊毛的PCR反应条件为：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，52 ℃，35 s，40个循环。

本发明建立的山羊绒、绵羊毛实时荧光PCR鉴别法特异性好、灵敏度高，能够满足轻纺日常检测的要求。

附图说明

图1为优化前的山羊、绵羊成分的实时荧光PCR结果；其中A. 绵羊成分；B. 山羊成分。

图2为实时荧光PCR反应体系的优化结果，其中A. 绵羊成分；B. 山羊成分。

图3为绵羊成分的灵敏度测定结果，其中A. DNA系列稀释内参基因；B. DNA系列稀释绵羊成分；C. 含量内参基因；D. 含量绵羊成分。

图4为山羊成分的灵敏度测定结果，其中A.DNA系列稀释内参基因；B. DNA系列稀释山羊成分；C. 含量内参基因；D. 含量山羊成分。

图5为供试材料中山羊绒、绵羊毛的实时荧光PCR鉴别结果；其中A. 内参基因；B. 绵羊成分；C. 山羊成分。

具体实施方式

1  试验材料