[发明专利]驴或驴源性成分实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针

说明书

技术领域

本发明涉及动物物种和动物源性成分鉴定技术领域，具体涉及一种驴或驴源性成分的检测方法；尤其涉及一种驴或驴源性成分的实时荧光PCR检测方法；此外，本发明还涉及检测驴或驴源性成分的引物和探针。

背景技术

目前畜禽肉食品的动物源性成分的鉴别检测已涉及到肉食品的工业、进出口贸易、市场及餐饮业等领域。国内外肉食品及饲料贸易市场中的检验检疫工作对高新技术的需求也越来越迫切。同时，各类人畜共患病也困扰着人类的生存健康。因此，研究出一种准确、快速、可靠的鉴别畜禽类动物源性成分的方法，就非常有必要。

目前，为了确定食物及饲料的真实成分，已经开发了很多对动物源性成分鉴别的方法，有物理、化学、免疫学和分子生物学等方法。

在分子生物学方法中，分子标记技术以其快速、准确、稳定、高效等优点显示出巨大的开发潜力和广阔的应用前景。目前在动植物源性成分鉴别检测中应用的分子标记主要包括核DNA、RNA、线粒体DNA(mtDNA)、和蛋白质分子标记等。PCR分子标记鉴别检测技术，具有特异性高、针对性强、灵敏度高、简便快速、对检测样品要求低(几乎所有的样本都可以作为PCR的材料，它只要求样本中有完整的靶序列核酸)，因此，无论是经过远途运输或低温保存多年的陈旧样本，都可以用于PCR扩增。

哺乳动物mtDNA在遗传上相对独立，是双链的超螺旋环状分子，具有基因组小(约16kb)、没有重复序列、生物个体内无组织特异性、每个细胞中含有大量线粒体基因组(哺乳动物约1000～2300个拷贝)等特点。因此，用mtDNA分子标记鉴别畜禽肉食品及饲料动物源性成分与核DNA分子标记相比，具有灵敏度高、精确度好、快速、降解小(加工过程中mtDNA保持较完整)、稳定易操作等优势。基于动物mtDNA的PCR分子标记技术的上述特点，加之实时荧光PCR的快速、灵敏等特点，因此在动物源性成分鉴别检测中的应用具有广阔的前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种驴或驴源性成分的实时荧光PCR检测方法。

本发明的目的在于提供一种驴或驴源性成分的扩增引物和探针。

本发明的另一目的是提供一种驴或驴源性成分的实时荧光PCR检测方法的扩增条件。

以解决准确、快速、可靠的用实时荧光PCR技术鉴定驴或驴源性成分。

本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现：

(1)设计引物：一种用于实时荧光PCR检测驴或驴源性成分的特异性引物和探针，其主要特点是上下游长度分别为25bp和26bp的核苷酸；探针长度为25bp的核苷酸，并在5’端标记上FAM荧光基因，3’端标记上ECLIPSE淬灭基因，序列如下：

上游引物F：5’-AATAGCTCTAGCCGTACGGCTAACT-3’

下游引物R：5’-CAGGATAATGAATGTAATAAGGGCTG-3’

探针序列P：5’(FAM)-TGCCGGACATCTTCTAATCCACCTT-3’(ECLIPSE)

(2)提取样品DNA。

(3)采用步骤(1)设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。

步骤(2)具体为：按DNA提取试剂盒说明提取样品DNA。

步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应体系为20μL，包括10μL 2×real time PCR Buffer(包含有dNTP，Mg²⁺以及Taq酶等)，步骤(1)设计的上下游引物F/R各0.4μL(终浓度为0.2μM)，TaqMan探针P 0.4μL(终浓度为0.2μM)，DNA模板2μL，超纯水补至20μL。

步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为：预变性95℃30sec；然后95℃15sec，60℃34sec循环40次。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：近年来随着人们对身体保健需求的日益增强，餐桌上的驴肉，以及阿胶等食品药品的需求不断增大，商家出于经济利益驱使投放大量非驴源性成分制成的商品，导致各类产品真假难辨。因此，研究出准确、快速、可靠的鉴定驴或驴源性成分的方法和技术，对于有效抵御假冒驴源性成分产品，使损害消费者利益的事件得到遏制，同时进一步完善了食品和药品检测体系，加大了对消费者利益的保护力度。同时对于经驴传播的某些疾病也可通过该方法鉴定其成分，从而控制其进出境，来控制这些疾病病原的传播与蔓延。本发明与现有技术相比，其检测的灵敏度也大大提高。

附图说明

图1为驴或驴源性成分实时荧光PCR检测方法特异性实验图。