[发明专利]用于检测KRAS基因突变的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测KRAS基因突变的试剂盒及其检测方法，更具体地说，本发明涉及一种用于检测KRAS基因第2外显子密码子12和/或密码子13突变的试剂盒及其检测方法。

背景技术

基因导向性的个体化治疗是近年来临床医学和药物研发的主要趋势。KRAS基因突变是目前较为确定的表皮生长因子受体（EGFR）靶向药物预测因素。研究表明，肿瘤患者KRAS基因突变状态与EGFR靶向药物治疗结、直肠癌、非小细胞肺癌的疗效密切相关，当患者肿瘤存在KRAS基因突变时，靶向药物疗效不佳。结、直肠癌和非小细胞肺癌患者使用EGFR靶向药物治疗前，应检测KRAS基因状态，该基因检测能为临床个体化治疗提供科学依据，避免不必要的用药和减少药物毒副作用。

目前对KRAS基因突变检测的方法主要包括：测序、单链构象多态性 (SSCP)、变性高效液相色谱 (DHPLC)、荧光定量PCR法、基因芯片、液相芯片等方法。测序法因为可以读到DNA每个碱基的变化，目前被认为是检测基因突变的金标准方法，但因为灵敏度低，检测异质性较高的临床肿瘤组织样本时假阴性率高，同时，测序步骤繁琐、耗时长，对设备和操作人员的要求较高，不易于形成标准化操作的临床诊断产品。SSCP、DHPLC、基因芯片、液相芯片等方法也因操作复杂、对设备要求高，目前仅在科研单位实验室应用。荧光定量PCR法检测基因突变是通过序列特异性探针实现的，该方法灵敏度高、特异性好，目前已有基于该方法的检测KRAS基因突变的试剂盒，但该方法需荧光标记的特异性探针，一种探针只能进行一种基因突变类型的检测，因此检测试剂成本高，操作相对复杂，目前临床上尚未大规模使用。

因此，有必要提供一种改进的方法以实现对KRAS基因突变的快速、有效且精确的检测。

发明内容

因此，本发明的目的之一在于：提供一种用于检测KRAS基因第2外显子密码子12和/或密码子13突变的试剂盒，所述试剂盒包括检测反应液；以及SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所表示的引物对。

在本发明的一个实施方式中，所述检测反应液包含PCR缓冲液、dNTP混合液、MgCl₂、DNA聚合酶以及荧光染料。在本发明的一个实施方式中，所述试剂盒还包括突变对照标准品和野生对照标准品，所述突变对照标准品包含KRAS基因第12密码子和/或第13密码子的突变型序列，所述野生对照标准品包含野生型KRAS基因序列。在优选的实施方式中，所述试剂盒还包括所述试剂盒的使用说明书。此外，本发明所使用的PCR缓冲液、dNTP混合液、MgCl₂、DNA聚合酶以及荧光染料皆为PCR反应的常用材料，可从市场购得。另外，荧光染料可选择饱和荧光染料，例如LC Green、LC Green Plus、Eva Green或SYTO 9等。

本发明的另一目的在于：提供一种用于检测KRAS基因第2外显子密码子12和/或密码子13突变的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 提取待测样品的基因组DNA；(b) 对所提取的基因组DNA进行PCR扩增，其中扩增使用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所表示的引物对；以及 (c) 对扩增产物进行HRM分析，从而确定所述密码子12和/或密码子13是否发生突变。

在一个实施方式中，上述步骤(a)中所述待测样品为来自结肠癌、直肠癌或非小细胞肺癌的肿瘤组织或其石蜡病理切片。优选地，所述待测样品为来自结肠癌、直肠癌或非小细胞肺癌的肿瘤组织。更优选地，所述待测样品为来自结肠癌的肿瘤组织。在另一个实施方式中，优选地，所述待测样品为来自结肠癌的肿瘤组织的石蜡病理切片。

在一个实施方式中，上述步骤(a)中所述基因组DNA的浓度被调节至2-8 ng / μL。优选地，所述基因组DNA的浓度被调节至3-7 ng / μL。更优选地，所述基因组DNA的浓度被调节至4-6 ng / μL。更优选地，所述基因组DNA的浓度被调节至4 ng / μL。

在一个实施方式中，上述步骤(b)中所述PCR扩增的反应条件为：在94℃预变性3-5分钟，然后以94℃ 10-15秒、65℃ 30-45秒进行50次循环。在优选的实施方式中，所述反应条件为：在94℃预变性4-5分钟，然后以94℃ 12-15秒、65℃ 30-40秒进行50次循环。在更优选的实施方式中，所述反应条件为：在94℃预变性5分钟，然后以94℃ 15秒、65℃ 30秒进行50次循环。