[发明专利]一种真核表达重组质粒及其构建方法与稳定表达该质粒的Vero细胞系

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种真核表达重组质粒及其构建方法与稳定表达该质粒的Vero细胞系。

背景技术

犬瘟热(Canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的一种犬科、鼬科等动物易患高度接触性传染病。该病是养犬业、毛皮动物养殖业危害最大的传染病之一，以厌食、双相热、结膜炎、胃肠炎和神经症状为典型特征，可引起大批犬、狐、貉等动物发病，发病死亡率为30～80％。近年来，犬瘟热病毒感染宿主的范围日益扩大，灵长目的猕猴，鳍足目海豹科的海豹、大熊猫、猫科中大型动物狮子、非洲的野狗等均有报道感染犬瘟热病毒。在我国，随着近几年来军犬、警犬、实验用犬和毛皮动物狐、貉等饲养量的大幅度增加以及异地交流的增多，犬瘟热在犬、狐、貉中的发病率和致死率均有升高的趋势，因此犬瘟热防控显得尤为重要。

病毒分离技术是对犬瘟热病毒致病机制研究的重要手段，但具有囊膜的犬瘟热病毒不易在环境中存活，因此难以用普通方法分离成功。目前，针对犬瘟热病毒野毒株的分离一般通过易感动物肺巨噬细胞与Vero或MCDK等传代细胞系共培养的方法，但此类方法存在操作复杂、耗费时间长和分离得到病毒效价不稳定等缺点外，而且由于以上传代细胞为犬瘟热病毒非敏感细胞，对于分离到的犬瘟热病毒很可能在适应细胞的过程中发生了毒力基因的突变，造成病毒株的致弱。由于犬瘟热病毒(尤其强毒株)在体外培养时缺乏敏感且适用的细胞或细胞系，造成犬瘟热病毒分离成功率较低(一般低于20％)，严重阻碍了对犬瘟热病毒病原学生物学及致病机制方面的研究。

2001年，Tatsuo等将CDV野毒株在人工表达犬信号淋巴细胞激活分子(SLAM又称CD150)的CHO细胞上感染，试验证实犬的SLAM为CDV感染的受体，CDV H蛋白通过识别SLAM而吸附到细胞表面起始病毒的感染过程。2003年，Seki等应用建立的稳定表达犬SLAM的Vero细胞系(Vero.DogSLAMtag)较Vero和B95a细胞更快速且敏感地从疑似犬瘟热病犬体内分离到犬瘟热病毒。由于Vero.DogSLAMtag中表达的tag标签为禽流感病毒HA蛋白的抗原表位，因此对该阳性Vero细胞系鉴定需要借助针对该表位的单克隆抗体进行免疫印迹或间接免疫荧光方法。因此，从该细胞系的构建立及鉴定所用方法较为繁琐。此外，由于该阳性Vero细胞系中犬SLAM表达量较低，造成病毒分离的敏感性不高，直接影响了犬瘟热病毒的分离效率。2010年，赵建军等成功克隆了狐、貉和水貂的SLAM基因，并证实其均能作为犬瘟热病毒感染的受体。

因此，构建一种高效表达且病毒嗜性敏感的SLAM基因的重组质粒并导入Vero细胞中，获得稳定表达该SLAM基因的Vero细胞系，对于快速且敏感的分离犬瘟热病毒及其对其致病机制研究具有现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种真核表达重组质粒及其构建方法与稳定表达该质粒的Vero细胞系。该真核表达重组质粒具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。应用该Vero细胞系，可以对犬瘟热病毒强毒株进行高效分离及应用于犬瘟热病毒致病机制的研究中。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种真核表达重组质粒具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。

该真核表达重组质粒，由GeneBank登录号为EU678639的貉SLAM基因(rSLAM)、编码6个组氨酸(6×his)的核苷酸序列和Kozak序列的融合基因，Pcmv，IRES，EGFP和SV40pA组成，如图15所示。其中，所述质粒的5’至3’端依次为Pcmv，所述融合基因，IRES，EGFP和SV40pA，如图13所示。Kozak序列，为存在于真核生物mRNA的一段序列，在翻译的起始中有增强蛋白表达量的作用。真核生物基因中起始密码子上、下游的最佳序列为，-3位为嘌呤碱基；+4位为G，起始密码子AUG中的A处于+1位。

作为优选，所述Kozak序列具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列。

本发明采用真核表达载体pIRES2-EGFP，购自美国Clontech公司，真核表达载体pIRES2-EGFP为一种双元表达载体，在多克隆位点(MCS)处插入的目的基因和EGFP在CMV启动子下共表达，既能对表达进行监控(通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达来反应目的蛋白的表达情况)，又能很好地保持目的蛋白本身生物学特性。