[发明专利]一种茶树无性系离体再生培养的方法

权利要求书

1.一种茶树无性系离体再生培养的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)选择外植体

从田间采集茶的新梢，经自来水冲洗干净；

(2)杀灭表面菌

将洗净的新梢切成带芽的单芽茎段，在超净台中先浸入浓度70％的乙醇溶液30s；接着置于含有0.1％吐温的浓度0.1％的升汞溶液浸泡7-10min，并不断搅动，最后用无菌水冲洗，作为茶树初代培养的外植体；

(3)初代培养

将上述外植体接种在初代培养基上，置于23-27℃、光照时间16h/d、光照强度800-2000lx条件下进行培养；每4周继代转接一次；所述初代培养基为：1/2MS加入BA 8.88μM和IBA0.49μM；

(4)离体再生

将培养获得的新梢转入再生培养基1，3-4周后，新梢基部形成愈伤，将带有愈伤的新梢转入再生培养基2，直至从新梢基部愈伤上不断分化出新芽；培养条件为23-27℃、光照时间16h/d、光照强度800-2000lx；所述再生培养基1为：1/2MS加入TDZ 0.05-0.1μM和IBA 0.49μM；所述再生培养基2为：1/2MS加入BA 8.88μM和IBA 0.49μM；

(5)新梢延伸

新梢基部愈伤分化出的新芽需在愈伤上进行延伸，延伸培养基为再生培养基2；待愈伤分化的新芽延伸为2-3cm的新梢时，将新梢从愈伤上切除，继续用于离体再生，再生条件、培养条件同步骤(4)；

(6)生根培养

切取步骤(5)中形成的新梢，用2450μM IBA处理新梢基部5min，再接种于生根培养基，培养条件同步骤(4)，所述生根培养基为：1/4MS加入0.1％活性炭；

(7)移栽

将步骤(6)中生根的茶无性系组培苗移栽至营养土中。

2.根据权利要求1所述的一种茶树无性系离体再生培养的方法，其特征在于：所述步骤(1)中新梢剪除叶片，每一节位留下叶柄保护腋芽，经自来水冲洗干净后，转入每升滴加2-3滴洗涤剂的自来水中浸泡15-20min，边浸泡边晃动，再用自来水冲洗干净。

3.根据权利要求1所述的一种茶无性系离体再生培养的方法，其特征在于：所述步骤(2)中经表面灭菌后的单芽茎段需置入无菌的0.2％聚乙烯吡咯烷酮中，聚乙烯吡咯烷酮为过滤除菌后使用。

4.根据权利要求11所述的一种茶无性系离体再生培养的方法，其特征在于：所述步骤(3)初代培养中外植体接种后先置于10-15℃避光2-3天，再置于23-27℃、光照时间16h/d、光照强度800-2000lx条件下进行培养。

5.根据权利要求1所述的一种茶无性系离体再生培养的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的愈伤是新梢基部经脱分化而形成的愈伤；该步骤中所述的新芽是新梢基部脱分化而来的愈伤经再分化而形成的。

6.根据权利要求1所述的一种茶无性系离体再生培养的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的愈伤是在再生培养基1上诱导出来后，需转至再生培养基2上进行芽的进一步分化和延伸。

7.根据权利要求1所述的一种茶无性系离体再生培养的方法，其特征在于：所述步骤(5)和(6)中的新梢是步骤(4)中的愈伤再生出的新芽在愈伤上延伸生长而来的。

8.根据权利要求1所述的一种茶无性系离体再生培养的方法，其特征在于：所述初代培养基、再生培养基1、再生培养基2和生根培养基灭菌前均于50-60℃下，调节pH至5.8，且均于121℃、104kPa下灭菌18-20min。