[发明专利]一种茶树无性系离体再生培养的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及到一种茶树组织培养再生体系建立的方法。

背景技术

茶[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]是世界三大饮料之一，因富含茶氨酸、儿茶素和咖啡碱而具药理和保健功能。茶树生产常因遭遇低温、病虫害等各种逆境而面临严峻挑战，使得生产者和企业遭受严重损失。

茶自交不亲和，遗传背景高度复杂，又因结实率低，常常得不到杂交种子，给育种研究带来很大困难，因而茶树育种至今仍以单株选育为主，这使得茶育种工作不仅周期长，难度大，而且盲目性也大。无性系遗传转化可以克服上述缺陷，在较短的时间内，不改变原品种的特性，人为定向培育具有优良特异性状的新品种。因此，建立适于茶无性系品种的高效离体再生方法对应用生物技术定向培育具有优良特异性状的茶树新品种十分必要。

茶因多年生木本作物和富含酚类化合物，这使得接种后外植体污染和褐化程度严重；又因无性系器官或组织多为已分化成熟细胞，在后续培养过程中较幼胚或种子等幼嫩组织的脱分化和再分化困难很多。目前，有关茶离体再生体系的成功报道多数是建立在幼胚或种子等外植体之上的，而茶自交不亲和，杂交后代性状广泛分离，幼胚或种子的遗传性状已远不同于其亲本，因此对茶品种的定向改良意义不大，且这种再生体系不适于无性系外植体。为此，人们不断尝试利用茶无性系器官或组织进行离体再生体系的建立，直至1996年，Kato.M利用茶幼叶为外植体获得了离体再生植株，但其外植体诱导体细胞胚胎及体胚再分化为植株的百分率分别只有6％和7.1％；2001年，桑达尔同样利用茶叶片为外植体进行再生体系的建立，再生率也只有30％；2005年，Aoshima以茶新梢顶点为外植体，在附加低浓度潮霉素(5mg/L)培养基上获得了43％的分化率，而对照只有4％，当潮霉素浓度达40mg/L时，再生率为0，这种再生方法对以抗生素作为筛选标记进行遗传转化时意义不大。综上所述，迄今为止建立在茶无性系器官或组织上的再生体系中外植体再生率都较低，难以满足遗传转化需要。

因此，建立茶无性系器官或组织的高效离体再生体系对利用遗传转化方法培育茶新品种极为必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效的茶离体再生培养方法，为茶规模化快繁和遗传转化体系的建立奠定基础。经过大量的试验研究，发明了以离体生长的新梢基部为外植体，采用新梢-新梢基部愈伤-芽的分化-新梢延伸的方法，在再生培养基1上诱导愈伤，在再生培养基2上进行芽的分化和延伸，建立高频稳定的茶再生体系。本发明愈伤诱导率达100％，芽再分化率达67.4％，愈伤再生系数高(＞10个芽/外植体)，生根率达70.8％，是一种可直接用于茶遗传转化的高频再生体系。

本发明的具体操作步骤如下：

(1)选择外植体

从田间采集茶[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]的新梢，经自来水冲洗干净；

(2)杀灭表面菌

将洗净的新梢切成带芽的单芽茎段，在超净台中先浸入浓度70％的乙醇溶液30s；接着置于含有0.1％吐温的浓度0.1％的升汞溶液浸泡7-10min，并不断搅动，最后用无菌水冲洗，作为茶树初代培养的外植体；

(3)初代培养

将上述外植体接种在初代培养基上，置于23-27℃、光照时间16h/d、光照强度800-2000lx条件下进行培养；每4周继代转接一次；所述初代培养基为：1/2MS加入BA 8.88μM和IBA0.49μM；

(4)离体再生

将培养获得的新梢转入再生培养基1，3-4周后，新梢基部形成愈伤，将带有愈伤的新梢转入再生培养基2，直至从新梢基部愈伤上不断分化出新芽；培养条件为23-27℃、光照时间16h/d、光照强度800-2000lx；所述再生培养基1为：1/2MS加入TDZ 0.05-0.1μM和IBA 0.49μM；所述再生培养基2为：1/2MS加入BA 8.88μM和IBA 0.49μM；

(5)新梢延伸

新梢基部愈伤分化出的新芽需在愈伤上进行延伸，延伸培养基为再生培养基2；待愈伤分化的新芽延伸为2-3cm的新梢时，将新梢从愈伤上切除，继续用于离体再生，再生条件、培养条件同步骤(4)；

(6)生根培养

切取步骤(5)中形成的新梢，用2450μMIBA处理新梢基部5min，再接种于生根培养基，培养条件同步骤(4)，所述生根培养基为：1/4MS加入0.1％活性炭；

(7)移栽