[发明专利]将人皮肤软骨分化为软骨细胞样细胞的方法

说明书

本发明专利申请是国际申请号为PCT/US2007/061590，国际申请日为2007年2月5日，进入中国国家阶段的申请号为200780004506.8，发明名称为“使用生物反应器的修复软骨的方法和组合物”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本发明要求2006年2月7日提交的题为“椎间盘修复方法”的美国临时专利申请第60/771,172号的优先权，还要求2006年3月24日提交的题为“用于椎间盘修复的多层多室三维聚合物支架(Multi-Layered Multi-Compartmental Three-Dimensional Polymeric Scaffold For Intervertebral Disc Repair)的美国临时专利申请第60/785,478的优先权，将这两份申请的全部内容纳入本文作为参考。

发明领域

本发明一般至少涉及药学、外科学、解剖学、生物学、细胞生物学和/或分子生物学领域。在具体的方面，本发明涉及软骨修复，例如关节软骨修复领域。更具体地说，本发明领域涉及在机械应激下使细胞生长、增殖和/或分化形成软骨细胞样细胞的细胞基质包封装置。

背景技术

通常，关节软骨是一种受损后不会自然再生的组织。近来，已尝试通过在实验室中再生一部分受损组织来重建受损的生物学组织。这种方法称为“组织工程”，已受到广泛关注。

组织工程涉及能够于生物学组织特异性相互作用的生物相容性材料的开发以制备功能性组织等价物。组织工程的基本概念是，从患者收集所需组织，由组织样本分离细胞，使细胞增殖，将增殖的细胞接种到可生物降解的聚合物支架上，体外培养细胞预定的时间，然后将细胞/聚合物构建物移植回患者体内。移植后，移植支架中的细胞利用通过体液的扩散获取的氧气和营养，增殖分化形成新的组织，支架则发生溶解。

用于再生生物学组织的支架通常包括用作基质的材料，使细胞粘附材料表面并形成三维组织。这种材料应是无毒、生物相容且可生物降解的。满足上述物理性质要求的最常用的可生物降解聚合物包括：有机聚合物，例如聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚-ε-己内酯(PCL)、聚氨基酸、聚酐、聚原酸酯；天然水凝胶，例如胶原、透明质酸、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖；合成水凝胶，例如聚(环氧乙烷)(PEO)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(反丁烯二酸丙烯酯-共-乙二醇)[P(PF-co-EG)以及它们的共聚物。

研究上述聚合物来构建多孔支架。然而，常规制造技术一般导致支架的多孔性低以至于不能充分支持细胞生长。支架表面的空隙常常发生阻塞，营养不能充分供给细胞，细胞难以生长进入支架内。近来，组织工程领域中显微制造技术的应用使得微米级分辨率的复杂支架的开发成为可能。这些支架称为“显微射流支架”，具有允许支架内流体流动的显微通道网络。该显微通道网络有助于向支架的不同部分提供营养物质和可溶因子。

支架还可用半透膜进行包封。美国专利公开第2006/0147486号涉及用半透膜包封的多孔支架。半透膜选择性地将营养物质从支架外部导入支架，同时将组织细胞产生的代谢废物排泄到支架外部。该公开描述了使细胞在支架内生长的体外方法，用于再生生物学组织。

美国专利6,627,422描述了一种半透膜包封的纱基质中含有细胞的装置。在这种情况下，半透膜允许植入的细胞接受营养物质，并且允许植入细胞产生的治疗性分子扩散至宿主细胞。该装置用于细胞疗法：包封的细胞向宿主分泌内源性蛋白质。该装置可用作人造生物器官(例如，分泌胰岛素的人造胰腺)

虽然营养物质扩散增加的支架构建技术取得了一些进展，但是，一旦移植到患者体内，支架的营养供应有限。事实上，在体内营养物质和氧通过邻近椎间盘的椎骨终板中的血管而被递送至盘细胞。在退行性盘疾病中，椎骨终板功能受损，不能使足够的营养物质扩散到植入的细胞支架。

可使用不同细胞类型来构建关节软骨。可使用从现有软骨活检获取的关节软骨的原代分化细胞(即软骨细胞)。这些细胞常常来自自体来源，因为异源细胞或来自尸体的细胞存在病原体转移的固有风险。间充质细胞干细胞(MSC)是一种骨髓中发现的胚胎样细胞，能够分化形成不同类型的间充质组织，尤其是软骨组织；因而成为软骨工程技术的另一细胞来源。