[发明专利]用慢病毒检测HIV耐药表型

权利要求书

1.本发明拟采用一种新的高效低毒慢病毒载体系统，建立检测HIV表型检测方法。

2.如权利1所述的慢病毒载体系统，其特征是装载有患者感染的HIV-1病毒Pol基因区和EGFP或者荧光素酶。

3.如权利1所述的慢病毒载体系统，其特征是以EGFP或者荧光素酶作为报告基团。

4.如权利1所述的慢病毒载体系统，其特征是在体外包装成具有单次感染能力的假病毒。

5.如权利1所述的慢病毒载体系统，其特征是具有单次感染能力。

6.如权利1所述的慢病毒载体系统，其特征是5’LTR的U3区被RSV的enhancer/promoter取代，使载体的复制不再依赖Tat。

7.如权利1所述的慢病毒载体系统，其特征是3’LTR的U3增强子区缺失，使其不再有启动/增强活性，成为自灭活(self-inactivating，SIN)载体。

8.如权利1所述的慢病毒载体系统，其特征是不具有复制能力，即该病毒基因组整合到细胞基因组后，不会产生新的子代病毒，也降低了对周围基因的意外激活，因此具有很好的安全性。

9.如权利1所述的慢病毒载体系统，其特征是病毒的env基因被来自水泡口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus)的VSV-G代替，使病毒能感染更多种细胞(包括分裂和非分裂细胞)，且病毒更趋稳定。

10.如权利1所述的慢病毒载体系统，其特征是HIV-1的所有辅助蛋白和调节蛋白基因(tat，vrf，vpr，vpu and nef等)均被删除，从载体基因组中缺失。

11.如权利1所述的慢病毒载体系统，其特征是3个蛋白Gag/MCS、Rev、VSV-G(代替HIV-1的Env)分别独立放置在3个质粒上(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)，且互相之间没有任何同源序列(见附图1)，大大降低了复制型慢病毒(RCL)产生的几率。

12.如权利1所述的慢病毒载体系统，其特征是pGag/Pol质粒上具有多克隆酶切位点(MCS)，并且其读码框与gag一致。

13.如权利1所述的慢病毒载体系统，其特征是报告基因EGFP或者Luc位于质粒pLenti EGFP/Luc上(见附图1)，且由SV40启动子控制报告基因EGFP或者Luc。

14.如权利1所述的慢病毒载体系统，其特征是包装好的假病毒结构如附图2所示。

15.如权利1所述的检测方法，其基本步骤是将HIV-1的pol基因区插入到慢病毒载体中，再将慢病毒载体感染细胞，在细胞内完成慢病毒的包装工作，收集细胞上清，浓缩、纯化得到高浓度的慢病毒颗粒，最后用所得慢病毒颗粒感染细胞，测定耐药性。

16.如权利1所述的检测方法，其特征是采用RT-PCR技术扩增HIV-1的pol基因区，目的基因片断覆盖蛋白酶区4-99位氨基酸和逆转录酶区38-320位氨基酸的基因区域。

17.如权利1所述的检测方法，其特征是将RT-PCR扩增所得片段插入到慢病毒载体pGap的MCS位置。