[发明专利]含甲型流感病毒核蛋白的融合基因及其构建和表达方法

权利要求书

1. 一种含甲型流感病毒核蛋白的融合基因pEGFP-N1-NP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述含甲型流感病毒核蛋白的融合基因的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）以甲型流感病毒核蛋白基因为模板，设计含限制性内切酶EcoRⅠ及SmaⅠ酶切位点的引物，PCR扩增，得带有双酶切位点的核蛋白基因；

（2）将核蛋白基因与T载体pMD19-T Simple Vector混合进行T克隆，经0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定后获得pMD19-T-NP质粒；

（3）将pMD19-T-NP质粒亚克隆至增强型绿色荧光示踪蛋白EGFP的目标载体pEGFP-N1，转化大肠杆菌DH-5α，培养后提取质粒，SmaⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定阳性克隆，即得融合基因pEGFP-N1-NP。

3.按照权利要求2所述含甲型流感病毒核蛋白的融合基因的构建方法，其特征在于：步骤（3）中亚克隆是指：采用限制性内切酶Sma Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pEGFP-N1质粒及pMD19-T-NP质粒分别获得纯化的pEGFP-N1和目的核蛋白片段，添加到连接反应中连接获得连接反应液。

4.按照权利要求2所述含甲型流感病毒核蛋白的融合基因的构建方法，其特征在于：步骤（3）中所述培养后提取质粒是将转化后的大肠杆菌DH-5α接种于含卡那霉素的LB培养板上培养，挑取单克隆菌落至含卡那霉素的S.O.C液体培养基上培养。

5.按照权利要求2所述含甲型流感病毒核蛋白的融合基因的构建方法，其特征在于：步骤（1）中所述PCR扩增的扩增引物为：

上游引物：5'-ccgcgaattcatggcgtctcaaggcaccaaacgat-3'；

下游引物：5'-cgcgcccgggcattgtcatactcctctgcatt-3'。

6.按照权利要求2述含甲型流感病毒核蛋白的融合基因的构建方法，其特征在于：步骤（1）中所述甲型流感病毒为H9N2。

7.权利要求1所述含甲型流感病毒核蛋白的融合基因的表达方法，其特征在于：通过Lipofectamine 2000将pEGFP-N1-NP融合基因转染HEK293T细胞，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达；用细胞免疫组化方法鉴定甲型流感病毒核蛋白的表达。