[发明专利]含甲型流感病毒核蛋白的融合基因及其构建和表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种含甲型流感病毒核蛋白的融合基因pEGFP-N1-NP及其构建和表达方法。

背景技术

甲型流感病毒是呼吸道感染的重要病原体，多次引起世界性流感大流行：1997年香港爆发高致病性H5N1禽流感疫情，首次证实禽流感可以感染人类，至今全球已感染562例，死亡329例；2009年甲型H1N1流感席卷全球，未来流感流行的病毒株将可能会出现在任何时间、世界的任何地方、以及任何动物来源的流感病毒重配株。甲型流感病毒核蛋白(Nucleoprotein,NP)是由流感病毒基因组第5片段编码的，其开放读码框含1494个核苷酸，在流感病毒的转录、复制及转运中发挥着重要的作用，在各个不同亚型中具有高度保守性并可产生免疫交叉保护。因此，对核蛋白功能的研究，将有助于进一步了解甲型流感病毒的致病机制，为防控流感大流行提供理论依据。

为了能够大量获得甲型流感病毒核蛋白，以便进行下一步研究，需要构建甲型流感病毒核蛋白NP基因真核表达载体。真核表达质粒载体pEGFP-N1表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP），构建NP与EGFP的融合基因，可使NP基因表达绿色荧光蛋白。所构建的融合基因可进行真核表达，对甲型流感病毒核蛋白的功能鉴定、药物靶点筛选及其致病机理的进一步研究奠定了重要的实验基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种含甲型流感病毒核蛋白的融合基因pEGFP-N1-NP及其构建和表达方法，该融合基因pEGFP-N1-NP的成功构建和表达可进行RNA干扰抑制流感病毒NP基因，并在细胞及病毒中进行功能鉴定。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

    本发明含甲型流感病毒核蛋白的融合基因pEGFP-N1-NP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1。

上述融合基因的构建方法，包括如下步骤：

（1）以甲型流感病毒核蛋白基因为模板，设计含限制性内切酶EcoRⅠ及SmaⅠ酶切位点的引物，PCR扩增，得带有双酶切位点的核蛋白基因；

（2）将核蛋白基因与T载体pMD19-T Simple Vector混合进行T克隆，经0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定后获得pMD19-T-NP质粒；

（3）将pMD19-T-NP质粒亚克隆至增强型绿色荧光示踪蛋白EGFP的目标载体pEGFP-N1，转化大肠杆菌DH-5α，培养后提取质粒，SmaⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定阳性克隆，即得融合基因pEGFP-N1-NP。

在上述融合基因的制备方法中，步骤（3）中亚克隆是指：采用限制性内切酶Sma Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pEGFP-N1质粒及pMD19-T-NP质粒分别获得纯化的pEGFP-N1和目的核蛋白片段，添加到连接反应中连接获得连接反应液。所述培养后提取质粒是将转化后的大肠杆菌DH-5α接种于含卡那霉素的LB培养板上培养，挑取单克隆菌落至含卡那霉素的S.O.C液体培养基上培养。

在前述融合基因的构建方法中，步骤（1）中所述PCR扩增的扩增引物为：

上游引物：5'-ccgcgaattcatggcgtctcaaggcaccaaacgat-3'，其中gaattc是EcoRⅠ的酶切位点；

下游引物：5'-cgcgcccgggcattgtcatactcctctgcatt-3'，其中cccggg是SmaⅠ的酶切位点。

在前述的构建方法中，所述模板为甲型流感病毒H9N2核蛋白基因。

前述甲型流感病毒核蛋白与绿色荧光蛋白融合基因pEGFP-N1-NP的表达方法：通过Lipofectamine 2000将pEGFP-N1-NP融合基因转染HEK293T细胞，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达；用细胞免疫组化方法鉴定甲型流感病毒核蛋白的表达。

与现有技术相比，本发明将甲型流感病毒核蛋白与绿色荧光蛋白融合，形成融合基因，该融合基因在转染真核表达细胞后可表达绿色荧光蛋白和甲型流感病毒核蛋白，该融合基因pEGFP-N1-NP的成功构建和表达可进行RNA干扰抑制流感病毒NP基因，并在细胞及病毒中进行功能鉴定。

附图说明

图1 为本发明融合基因的结构示意图；

图2 为目的基因 NP PCR扩增结果。其中M：分子质量标准；1：NP-F、NP-R扩增NP基因片段。

图3 为NP基因TA克隆质粒电泳结果。其中M：分子质量标准；1-7：可能构建成功的NP基因TA克隆质粒；8、9：未构建成功的NP基因TA克隆质粒。