[发明专利]恶性疟原虫pfs25蛋白突变体及其酵母表达方法

说明书

技术领域

本发明属于传染病防治领域，具体涉及疟疾的防治，尤其涉及用于传播阻断型恶性疟疾疫苗的候选靶抗原。

背景技术

疟疾是世界上分布和流行最广的寄生虫性疾病之一，世界上有20亿人口生活在疫区。每年全球大约有3亿人口患病，其中50％是由恶性疟疾原虫引起的，5岁以下儿童患病人数约为250万，每年死于疟疾的人口约100万-300万。我国疟疾每年患病人数为10万左右。近年来，随着抗药疟原虫(疟疾病原体)和抗药按蚊(传播媒介)的出现，疟疾的防治面临更大的挑战。

疟原虫生活史复杂，包括有性、无性两个阶段三个时期，即在有性阶段的配子期和无性阶段的细胞前期及红细胞内期。由于疟原虫抗原在各个时期不同，抗原性较弱且有多个抗原表位，加之疟原虫的致病机理尚不十分清晰，这些因素给疟疾疫苗的研究带来了极大的困难。

对疟原虫抗原的研究，人们发现某些特异性抗原，有望成为疟疾疫苗的侯选物。其中一些重要抗原，如在子孢子表面表达的环子孢子蛋白(CSP)、在肝和血两个时期表达的裂殖子表面蛋白(MSP)、在有性阶段表达的合子表面或动合子表面抗原(Pfs25)等，已经作为疟疾候选疫苗的保护性抗原，并取得了初步的成果。

1988年Kaslow DC等首次报道了位于合子或动合子表面膜蛋白的Pfs25蛋白质，结果表明该蛋白质由217个氨基酸组成，富含半胱氨酸，其分子特征是存在四个“EGF样的结构域”(Nature.1988May 5；333(6168)：74-6.)。1991年BarrPJ等报道了重组Pfs25蛋白作为传播阻断型疫苗在试验动物上的效果(The Journal of experimental medicine.1991Nov 1；174(5)：1203-8.)。KaslowDC等在美国专利US5217898公开了酵母表达Pfs25突变体的方法，该突变体称为Pfs25B，由相当于Pfs25天然序列22-188位的氨基酸组成，其中相当于天然序列112、165、187位的天冬酰胺被替换成丙氨酸。2003年Zou L等报道在毕赤酵母中表达pfs25蛋白质突变体，该突变体相当于Pfs25天然序列23-193位的氨基酸组成，其中相当于天然序列112、165、187位的天冬酰胺被替换成谷氨酰胺(Vaccine.2003Apr2；21(15)：1650-7.)。尽管上述两种突变体在动物体内表现出传播阻断作用，并进行了I期临床安全性研究，但在进一步开发中都存在问题。因此本领域迫切需要研制有效的药物或疫苗来防治这种疾病。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新的恶性疟原虫Pfs25蛋白突变体，作为传播阻断疫苗的候选抗原。本发明要解决的另一问题是提供一种高效、经济的酵母表达Pfs25蛋白突变体的方法。

本发明的第一方面，提供了一种恶性疟原虫Pfs25蛋白突变体，该突变体相当于Pfs25天然蛋白23-193位的氨基酸序列，并且第112、165、187的天冬酰胺突变为谷氨酸，具体见SEQ1。

本发明的第二方面，提供了一种采用酵母偏爱密码子的编码Pfs25蛋白突变体的核苷酸序列，具体见SEQ2。

本发明的第三方面，提供了一种在毕赤酵母中表达Pfs25蛋白突变体的方法，包括如下步骤：

(1)将Pfs25蛋白突变体编码基因置于三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子的下游，构建重组酵母菌；

(2)以YPD培养基培养重组酵母菌；

(3)补加葡萄糖维持发酵液中的葡萄糖终浓度在0.5～1g/L范围；

(4)培养24～72小时，收获培养上清，提取目的蛋白。

其中所述的Pfs25蛋白突变体是指相当于Pfs25天然蛋白第112、165、187的天冬酰胺被谷氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸替换。更优选的，相当于Pfs25天然蛋白第112、165、187的天冬酰胺被谷氨酸替换。最优选的，Pfs25蛋白突变体是SEQ1定义的突变体。

在一个优选的方案中，Pfs25重组酵母菌在29.0℃、pH6.0～4.0、溶氧＞20％、条件下发酵培养。

在更优选的方案中，发酵过程中发酵过程中转速约350rpm，保持通气速度200L/h(压缩气体)。

在更优选的方案中，发酵液中加入Antifoam 204作为消泡剂。

本发明的恶性疟原虫Pfs25蛋白突变体(简称Pfs25-3E)，能够与针对Pfs25标准蛋白的单克隆抗体4B7特异性反应，用于小鼠免疫，能够诱导产生高滴度的抗Pfs25抗体，是一种可用于阻断传播疫苗研制的良好的候选抗原。