[发明专利]一种细胞色素C的纯化工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞色素C的纯化工艺，具体涉及采用前沿疏水色谱法纯化细胞色素C的工艺，属于生化分离技术领域。

背景技术

细胞色素（cytochrome）是各种生物体中都很常见的蛋白质，它是一类含有铁卟啉基团的电子传递蛋白，只存在于需氧细胞中，广泛存在于真核生物的线粒体内膜和内质网中，植物的叶绿体中，以及光合成微生物和细菌中。细胞色素在线粒体内膜上起传递电子的作用。细胞色C (cytochrome c) 是细胞色素的一种，它在线粒体呼吸链上位于细胞色素B 和细胞色素氧化酶之间，是呼吸链的一个重要组成部分。每分子细胞色素C含有一个血红素和一条多肽链。细胞色素C是一种稳定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，故常用酸性缓冲液提取。它对热比较稳定，不易变性，对酸碱也较稳定，可抵抗0.3 mol/L氢氧化钾溶液的长时间处理。

在酶存在的情况下，细胞色素C对组织的氧化、还原有迅速的酶促作用。通常外源性细胞色素C不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素C便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，提高氧的利用。细胞色素C可用于组织缺氧的急救和辅助用药，如一氧化碳中毒、催眠药中毒、新生儿窒息、严重休克缺氧、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难、高山缺氧、脑缺氧、心脏疾病引起的缺氧等。

目前临床上应用的细胞色素C主要是从猪心中分离纯化的制品。其技术路线为：将新鲜猪心搅碎后得心肌碎肉，用稀硫酸溶液提取，用稀氨水中和，将所得提取液吸附于人造沸石，用低浓度的硫酸铵溶液进行洗脱，再依次用硫酸铵沉淀法和三氯乙酸沉淀法对洗脱液进一步纯化，将所得沉淀溶解后对蒸馏水进行透析，然后再用弱阳离子交换树脂对其进行精纯化。目前工业上主要采用这一工艺路线制备细胞色素C。这种工艺路线繁琐、步骤多、耗时长，每公斤猪心仅可得约200 mg细胞色素C。

近年来，一些研究人员对此路线进行了一些改进。其中结果较好的是李宝珠等（李宝珠, 赵丽哲, 宁晓玲，中国生化药物杂志，1995, 16, 221-223）用凝胶过滤色谱法，以葡聚糖凝胶Sephadex G-200为分离介质，代替了上述传统技术路线中的弱阳离子交换色谱，使得细胞色素C的产率提高到340 mg/kg猪心；然而，凝胶过滤色谱法的样品负载量低，不利于大规模成产，而且凝胶过滤法分离速度很低，导致该方法比广泛采用的传统方法更加耗时。美国Amberlite IRC-50阳离子交换树脂是目前细胞色素C纯化中应用最为广泛的树脂，价格很高，虽然有人尝试用国产的树脂代替它，但效果均不理想（何献君, 陈红, 陈雅惠, 等, 中国生化药物杂志, 2008, 29(5): 324-326）。上述方法不但繁琐耗时，而且无一例外都采用了三氯乙酸沉淀对细胞色素C进行纯化，三氯乙酸极易引起细胞色素C的变性聚合和脱酰胺（李宝珠, 赵丽哲, 宁晓玲，中国生化药物杂志，1995, 16, 221-223）。

姚从等（姚从, 柯从玉, 白泉, 等，色谱，2004, 22: 399-402）采用疏水色谱法一步从猪心提取液中获得了高纯度的细胞色素C，这种方法虽然简单方便，但由于未经过硫酸铵或三氯乙酸沉淀等前处理，杂蛋白含量太多，使得色谱柱上绝大部分吸附位点被杂蛋白所占据，蛋白纯化效率低，只适合实验室规模的分离纯化，不适用于大规模的生产。为了提高色谱柱的利用效率，将猪心细胞色素C的粗提液首先用硫酸铵沉淀，然后将细胞色素C和剩余杂蛋白同时吸附在疏水色谱柱上，然后再用疏水色谱法在洗脱模式下对其进行分离（姚从，西北大学硕士学位论文，西安，2004），使得细胞色素C的上样量和色谱柱的利用效率得到了较大程度的提高。然而，柱填料利用率和生产效率仍然比较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种细胞色素C的纯化工艺，以克服现有技术纯化步骤多、色谱填料利用率低、生产效率低等不足。

一种细胞色素C的纯化工艺，包括以下步骤：

（1）从动物脏器或者酵母中提取得到细胞色素C的粗提液；

（2）向粗提液中加入无机盐进行盐析，静置离心弃去沉淀的杂蛋白，收集上清液；

（3）加缓冲液调节上清液中无机盐浓度至20% ~ 35%，再用前沿疏水色谱法对其进行纯化，即将所得溶液连续上样于预先用20% ~ 35%的无机盐溶液平衡过的疏水色谱柱中，收集穿透液；

（4）用20% ~ 35%无机盐溶液冲洗色谱柱至吸光度达到稳定，收集色谱流出液，与穿透液合并，即为纯化后的细胞色素C。

所述动物脏器是猪、牛、羊、马或狗的心脏、肝脏、肾脏。