[发明专利]利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救的方法及其专用表达载体

权利要求书

1.一种利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救的专用表达载体，是含有一个或多个相同或不同蛋白转导肽的原核表达载体。

2.根据权利要求1所述的专用表达载体，其特征在于：所述蛋白转导肽为：TAT、Antp、VP22、Poly(Arg)和/或Poly(Lys)，优选为TAT。

3.根据权利要求1所述的专用表达载体，其特征在于：用于构建所述原核表达载体的出发载体可为任意一种外源基因的原核表达载体，如pET28、pBV220、pET30、pCRT7/CT-TOPO、pET101/D-TOPO或pQE30，优选为pET28。

4.一种利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救的方法，是将秀丽线虫体内表型明显的功能蛋白的编码基因插入权利要求1或2或3所述专用表达载体中，将得到的原核表达载体转化入大肠杆菌原核表达系统并诱导表达，将得到的重组大肠杆菌喂饲功能蛋白缺失秀丽线虫或野生型株系秀丽线虫而实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

1)筛选秀丽线虫体内表型明显的功能蛋白并克隆其编码基因；

2)将功能蛋白编码基因插入上述专用表达载体中，得到含有蛋白转导肽编码区和功能蛋白编码基因相融合的原核表达载体；

3)将步骤2)构建的原核表达载体转化入大肠杆菌原核表达系统；

4)原核表达载体的诱导表达及蛋白表达水平检测；

5)将表达功能蛋白的重组大肠杆菌喂饲功能蛋白缺失秀丽线虫或野生型株系秀丽线虫；

6)秀丽线虫表型筛选和功能蛋白调控因子表达水平检测。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中大肠杆菌原核表达系统的宿主菌为：BL21、DH5α、HB101、JM109、OP50或耐辐射奇球菌。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中采用化学试剂诱导外源基因在大肠杆菌原核表达系统中表达，其中，化学试剂诱导表达条件为：诱导剂IPTG诱导表达(终浓度1mM)；诱导表达的OD₆₀₀＝0.6-1.0；诱导表达时间6-8小时；或

所述步骤4)中采用温度诱导外源基因在大肠杆菌原核表达系统中表达，其中，温度诱导表达条件可为：诱导表达的OD₆₀₀＝0.4-0.6；诱导表达温度42℃-44℃；诱导表达时间6-8小时。

8.根据权利要求5或6或7所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中的蛋白表达水平检测可采用SDS-PAGE和/或免疫印迹法。

9.根据权利要求5至8任一所述的方法，其特征在于：所述步骤5)中喂饲秀丽线虫的大肠杆菌是步骤4)中鉴定表达功能蛋白的菌株且预先涂布到LB或NGM平皿中。

10.根据权利要求5至9任一所述的方法，其特征在于：所述步骤6)中秀丽线虫表型筛选包括形态结构变化和细胞水平变化，如是否出现体型变小或肥胖、是否出现空泡现象等；功能蛋白调控因子包括蛋白质，DNA和RNA等，其表达水平筛选可以为免疫印迹，凝胶迁移实验和聚合酶链式反应等。