[发明专利]利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救的方法及其专用表达载体

说明书

技术领域

本发明属于生物技术产品应用领域中蛋白拯救的方法，特别是涉及一种利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救的方法及其专用表达载体。 

背景技术

秀丽线虫作为第一个完成全基因组序列测定的多细胞真核模式生物，因其细胞数量明确、遗传背景清楚、基因组小及易于操作等优点已广泛应用于遗传学、发育生物学、神经生物学和分子生物学等多个研究领域(Greer et al.Members of the H3K4trimethylation complex regulate lifespan in a germline-dependent manner in C.elegans.Nature.2010 Jul 15，466(7304)：383-7)。基于秀丽线虫平台规模化筛选其体内功能性蛋白的作用已成为目前研究的热点。传统基因水平上的显微注射和RNA干涉虽能到达研究秀丽线虫体内功能蛋白的作用，但由于其存在操作繁琐、成本高、周期长及破坏性大等缺点，更甚至于会出现功能蛋白不表达的现象，使秀丽线虫体内重要功能蛋白的研究及相应表型的筛选受到了极大限制(Rieckher et al.Transgenesis in Caenorhabditis elegans.Methods Mol Biol.2009，561：21-39；Shyu et al.Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis.Nat Protoc.2008，3(4)：588-96.)。自然条件下秀丽线虫体内功能蛋白不表达主要是由于其体内基因突变和/或基因缺失导致的，基于这类基因异常的秀丽线虫的研究结果不可靠，而基于蛋白水平针对秀丽线虫本身的修复研究尚未展开。 

发明内容

发明人在长期从事秀丽线虫体内功能蛋白的原核表达研究中发现，通过直接喂饲体外高效表达秀丽线虫体内功能蛋白的大肠杆菌不仅可以实现其突变株系表型的回 复，而且可改变其因基因突变导致的蛋白功能缺失，进而达到蛋白拯救(protein rescue)的目的。本发明的目的是提供一种利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救的专用表达载体。 

本发明所提供的专用表达载体，是含有一个或多个相同或不同蛋白转导肽的原核表达载体。 

所述蛋白转导肽可为：TAT、Antp、VP22、Poly(Arg)和/或Poly(Lys)等，优选为TAT。 

用于构建所述原核表达载体的出发载体可为任意一种外源基因的原核表达载体，如pET28、pBV220、pET30、pCRT7/CT-TOPO、pET101/D-TOPO或pQE30等，优选为pET28。 

本发明的第二个目的是提供一种利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救的方法。 

本发明所提供的利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救的方法，是将秀丽线虫体内表型明显的功能蛋白的编码基因插入权利要求1或2或3所述专用表达载体中，将得到的原核表达载体转化入大肠杆菌原核表达系统并诱导表达，将得到的重组大肠杆菌喂饲功能蛋白缺失秀丽线虫或野生型株系秀丽线虫而实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救。 

可包括以下具体步骤： 

1)筛选秀丽线虫体内表型明显的功能蛋白并克隆其编码基因； 

2)将功能蛋白编码基因插入上述专用表达载体中，得到含有蛋白转导肽编码区和功能蛋白编码基因相融合的原核表达载体； 

3)将步骤2)构建的原核表达载体转化入大肠杆菌原核表达系统； 

4)原核表达载体的诱导表达及蛋白表达水平检测； 

5)将表达功能蛋白的重组大肠杆菌喂饲功能蛋白缺失的秀丽线虫； 

6)秀丽线虫表型筛选和功能蛋白调控因子表达水平检测。 

在上述利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救的方法中，所述步骤3)中大肠杆菌原核表达系统的宿主菌可为：BL21、DH5α、HB101、JM109、OP50或耐辐射奇球菌等。 

上述重组表达载体和重组菌均可按照常规方法构建。