[发明专利]奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗GapC蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地说，涉及一种奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗GapC蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

奶牛乳房炎(Bovine mastitis)是危害我国奶牛饲养业重大疾病之一。根据国内外许多学者的研究发现，链球菌属是引起乳房炎的最主要病原菌之一。目前国内乳房炎疫苗方面主要是全菌体灭活疫苗。该疫苗虽具有一定的保护力，但没有异源菌株保护力，因而对新生菌不具有免疫预防的效果。Mackie等报道使用福尔马林灭活后的无乳链球菌菌苗对奶牛无保护力。Giraudo等人采用了乳房链球菌和停乳链球菌多联灭活苗，接种疫苗并不能显著降低奶牛由链球菌引起的乳房炎的发生。奶牛中链球菌主要有五类：无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、化脓链球菌和粪链球菌，而其中以无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌为常见病原菌。近年来，研究表明链球菌表面脱氢酶位于细菌表面，具有甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)活性，与血纤维蛋白溶酶结合，在疾病发展过程和信号转导过程中起到重要作用，被认为是疫苗发展的良好靶位点。无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌GapC在DNA和氨基酸水平上有相当的同一性，这就暗示了GapC蛋白可能作为一种抗原，用于保护奶牛对抗无乳链球菌、停乳链球菌以及乳房链球菌感染。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗GapC蛋白；第二目的是提供奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗GapC蛋白的制备方法；第三目的是提供一种含有奶牛乳房炎链球菌GapC蛋白的亚单位疫苗。

为了实现本发明的第一目的，本发明提供了一种奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗GapC蛋白，所述GapC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了编码所述GapC蛋白的相应基因，其具有SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了所述基因的表达载体及其宿主细胞。

为了实现本发明的第二目的，本发明提供了奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗GapC蛋白的制备方法，该方法包括下述步骤：

(1)提取牛源链球菌DNA序列；

(2)根据NCBI数据库已公布序列AF375662设计引物，PCR扩增出GapC基因；

(3)将回收的该基因与pMD18-T载体连接后，转化到大肠杆菌XL-1-Blue中，经酶切鉴定，筛选阳性克隆，序列测定；

(4)酶切pMD18-T-GapC及pQE-30质粒，构建重组载体pQE-30-GapC，转化大肠杆菌XL-1-Blue，筛选出的阳性克隆培养后提取质粒，进行双酶切鉴定；

(5)在大肠杆菌XL-1-Blue中获得高表达的上述重组工程菌，随后经镍柱纯化后得到目的蛋白，即为GapC蛋白，分子量为38kD。

其中，所述重组工程菌经过发酵培养进行优化，其发酵培养的条件为37℃、pH值7.0、装液量20％、种龄12-16h、转数180-220rpm，而接种量为1％-3％。

其中，扩增GapC基因所用的引物如下所示：

5′-CGCATGGTAGTTAAAGTTGGTATT-3′

5′-GACAGCGATTTTTGCAAAATACTC-3′。

其中，所述PCR反应条件为：95℃预变性15min，94℃ 45s，56℃ 45s，72℃ 2min，30个循环，72℃ 10min。

其中，所述牛源链球菌为停乳链球菌(S.dysgalactiae)。

本发明还提供了含有上述GapC蛋白的亚单位疫苗，该疫苗由GapC蛋白溶液与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂按1∶1混合混合乳化制成，其中GapC蛋白溶液的浓度为3.3mg/ml-4mg/ml。

本发明还提供了上述GapC蛋白，制备所述GapC蛋白的方法在制备预防奶牛乳房炎亚单位疫苗中的应用。

本发明利用牛源链球菌GapC蛋白制备的亚单位疫苗对奶牛乳房炎常见的三种链球菌都具有交叉保护性，与其他疫苗相比具有更广谱的保护性，可作为奶牛乳房炎亚单位疫苗的候选抗原。

附图说明

图1为本发明所述PCR扩增得到的GapC基因片段大小为1005bp；

图2为本发明所述重组质粒pQE-30-GapC经BamHI和Sal I双酶切，获得预期大小的两个目的基因片段(3400bp和1005bp)；