[发明专利]一种II类拟除虫菊酯人工抗原的合成方法

权利要求书

1.一种II类拟除虫菊酯人工抗原的合成方法，其特征在于以苯醚氰菊酯为原料，采用高锰酸钾和高碘酸钠进行氧化，得到人工半抗原；采用活性酯法将半抗原与载体蛋白BSA相连，用紫外分光光度法和SDS-PAGE法估算免疫原的偶联比；步骤为：

（1）II类拟除虫菊酯半抗原的制备

称取1.20g苯醚氰菊酯于100mL的具塞三角瓶中，再加入25.0mL的叔丁醇和17.0mL的水，混匀；然后称取3.48mg的NaIO₄，42.57mg KMnO₄和9010mg Na₂CO₃分别加入上述的三角瓶中；最后加入相转移催化剂甲基三辛基氯化铵，常温下反应过夜；反应结束后，用6N盐酸进行酸化，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，然后用硫代硫酸钠溶液洗涤有机相，接着用无水硫酸镁干燥，浓缩，柱层析法纯化，洗脱液为以质量比石油醚︰乙酸乙酯︰醋酸=69.9︰30︰0.1的混合溶剂，收集Rf=0.36的组分，浓缩，得到淡黄色的油状物，为II类拟除虫菊酯半抗原；

（2）II类拟除虫菊酯人工抗原制备

称取50.0mg的半抗原，7.8mg 1-乙基-碳二亚胺盐酸盐EDC，0.66mg二甲基吡啶DMAP和4.1mg三乙胺放入反应瓶A中，再加入300 μL N,N-二甲基甲酰胺DMF溶解后，得到A液；然后在反应瓶B中加入9.32mgN-羟基琥珀酸亚胺NHS和100μL N,N-二甲基甲酰胺DMF，溶解后得到B液；将B液逐滴滴加到A液中，室温下反应12h，得到C液；称取18mg的BSA溶于4mL pH 8.4的硼酸盐缓冲溶液中，得蛋白质溶液；在冰浴下，将C液逐滴滴加到蛋白质溶液中，反应6h；反应结束后，离心，取上清，得到II类拟除虫菊酯人工抗原混合液；

透析袋前处理：剪取9.0cm的透析袋，煮沸6-8min，再用去离子水冲洗5次，保存在4℃去离子水中备用；

将II类拟除虫菊酯人工抗原混合液移入透析袋中，用0.01M pH 7.4的的磷酸盐缓冲液透析72h，6-8h更换一次透析液，期间更换透析液7-9次，最后将II类拟除虫菊酯人工抗原分装在1.0mL的离心管中，保存在-20℃，备用；

（3）II类拟除虫菊酯人工抗原的鉴定

偶联比测定：采用紫外分光光度法对II类拟除虫菊酯人工抗原的偶联比进行测定；  

抗体效价测定：采用酶标板法进行测定。