[发明专利]一种II类拟除虫菊酯人工抗原的合成方法

说明书

技术领域

一种II类拟除虫菊酯农药的人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

II类拟除虫菊酯农药是一类重要的合成杀虫剂，具有广谱、高效、低毒、低残留的特点，广泛用于农业、林业、动物养殖和公共卫生等领域的害虫防治。随着II类拟除虫菊酯类农药的大量使用，农药残留不仅造成了环境污染，而且还危害到人类健康。研究表明：菊酯类农药具有潜在的遗传毒性、生殖毒性以及免疫毒性，因此，发达国家对农产品中农药残留已提出了针对技术壁垒的倾向性限量指标，从而使农畜产品中的农残问题引起全球性的关注。目前拟除虫菊酯的残留检测方法较多，如高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-电子捕获法(GC-ECD)以及气相色谱-质谱(GC-MS)等。对于这些色谱检测方法来讲，尽管其灵敏度高，准确性好，但样品的前处理净化技术步骤繁多，造成耗时长，而且仪器贵，需要专业人员操作，特别不适用于现场快速检测的要求。上个世纪80年代以来，随着免疫学技术在农药残留检测中的应用，酶联免疫分析(ELISA)技术测定农药残留现已发展为菊酯类农药多残留检测的重要方法之一，具有专一性强，操作简单，快速、灵敏的优点，而酶联免疫的关键技术之一是免疫原的设计和合成。到目前为止，国内关于II类拟除虫菊酯多残检测的报道尚没有针对其全部共同结构的半抗原合成的免疫原，为此设计合成了含有II类拟除虫菊酯全部共同结构的半抗原用来检测II类拟除虫菊酯的完全抗原的制备。

发明内容

本发明的目的是提供一种通用人工抗原的合成方法。所制备的产品用于II类拟除虫菊酯农药的免疫分析方法研究，为今后的研究提供了一种新型的人工抗原。

本发明的技术方案：一种II类拟除虫菊酯人工抗原的合成方法，以苯醚氰菊酯为原料，通过高锰酸钾和高碘酸钠进行氧化，得到II类拟除虫菊酯农药的半抗原，用活性酯法将其与载体蛋白BSA偶联，用紫外分光光度法和SDS-PAGE法估算偶联物的偶联比。其反应方程式为：

其合成步骤为：

（1）II类拟除虫菊酯半抗原的制备

称取1.20g(3.2mmol)苯醚氰菊酯于100mL的具塞三角瓶中，再加入25.0mL的叔丁醇和17.0mL的水，混匀；然后称取3.48mg（0.22mmol）的NaIO₄，42.57mg(3.6mmol)KMnO₄和9010mg(85mmol)Na₂CO₃分别加入上述的三角瓶中。最后加入相转移催化剂甲基三辛基氯化铵，常温下反应过夜。反应结束后，用6N盐酸进行酸化，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，然后用硫代硫酸钠溶液洗涤有机相，接着用无水硫酸镁干燥，浓缩，柱层析法纯化，以质量比石油醚：乙酸乙酯:醋酸=69.9:30:0.1，收集R_f=0.36的组分，浓缩，得到淡黄色的油状物即为II类拟除虫菊酯半抗原。

（2）II类拟除虫菊酯人工抗原制备

称取50.0mg (0.027mmol)的半抗原，7.8mg (0.04mmol)1-乙基-碳二亚胺盐酸盐（EDC），0.66mg (0.0054mmol)二甲基吡啶(DMAP)和4.1mg (0.04mmol)三乙胺放入反应瓶A中，加入300μLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解后，得到A液；然后在反应瓶B中加入9.32mg（0.081 mmol）N-羟基琥珀酸亚胺（NHS）和100μL N,N-二甲基甲酰胺（DMF），溶解后得到B液。将B液逐滴滴加到A液中，室温下反应12小时，得到C液。称取18mg(0.27μmol)的BSA溶于4mL pH 8.4的硼酸盐缓冲溶液中，得蛋白质溶液。在冰浴下，将C液逐滴滴加到蛋白质溶液中，反应6小时。反应结束后，离心，取上清，得到II类拟除虫菊酯人工抗原混合液。

透析袋前处理：透析袋前处理：剪取9.0cm的透析袋，煮沸6-8min，再用去离子水冲洗5次，保存在4℃去离子水中备用；

将II类拟除虫菊酯人工抗原混合液移入处理过透析袋中，用0.01M pH 7.4的的磷酸盐缓冲液（PBS溶液）透析72小时，6-8小时更换一次透析液，期间更换透析液6-9次。最后将II类拟除虫菊酯人工抗原混合液分装在1.0mL的离心管中，保存在-20℃，备用。

（3）II类拟除虫菊酯农药人工抗原的鉴定

偶联比测定：采用紫外分光光度法对II类拟除虫菊酯人工抗原的偶联比进行测定；  

抗体效价测定：采用酶标板法进行测定。