[发明专利]家蚕中肠特异表达启动子P3及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及家蚕中肠特异表达启动子，还涉及含有该启动子的转基因载体及该转基因载体的应用。

背景技术

家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目模式生物。家蚕基因组框架图和精细图谱的绘制工作相继在2004和2008完成，标志着人类对家蚕的研究和认识正式进入后基因组时代。对家蚕基因的研究主要采取 “发现基因，研究基因，利用基因” 的策略，目前发现了大量功能未知的家蚕基因，但是对家蚕基因研究进展却十分缓慢，进一步限制了利用家蚕基因。转基因和RNA干扰（RNAi）技术是目前研究基因功能最有效的方法，由于家蚕物种本身的特点，在利用RNAi技术研究基因功能方面存在局限，所以转基因技术是研究家蚕基因功能最有效的手段。但是许多功能基因都为组织特异性表达，因此利用转基因技术研究组织特异表达基因需要由组织特异启动子启动。目前家蚕组织特异表达启动子较单一，只有定位于丝腺和脂肪体表达的组织特异启动子报道，导致家蚕转基因载体中组织特异启动子缺乏，因此限制了对家蚕组织特异表达基因的研究。

研究表明家蚕的许多重要基因都特异表达于中肠。但是，中肠组织特异的启动子未见报道，这使科研人员在通过转基因等技术手段研究中肠组织特异表达基因时感觉很棘手，使相关研究很难开展，同时增加了利用中肠组织特异表达基因的难度。

因此急需一种家蚕中肠启动子，构建含有家蚕中肠启动子P3的表达载体，为家蚕转基因提供中肠组织特异表达载体。

发明内容

有鉴于此，本发明目的之一在于提供一种启动子，该启动子在家蚕中肠特异性启动。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案为：

家蚕中肠特异表达启动子P3，所述家蚕中肠特异表达启动子P3含有如SEQ ID No:2所示核苷酸序列，所述家蚕中肠特异表达启动子P3的碱基长度不超过2073，源于家蚕BGIBMGA008060基因。

进一步，所述家蚕中肠特异表达启动子P3的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

进一步，所述家蚕中肠特异表达启动子P3的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。

本发明目的之二在于提供家蚕中肠特异性启动子的制备方法，该方法操作简单，重现性好。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述家蚕中肠特异表达启动子P3的制备方法，具体步骤如下：以家蚕基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得家蚕中肠特异表达启动子P3，所述左、右引物分别如SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示，PCR扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性40秒、49℃退火40秒、72℃延伸2分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。

本发明目的之三在于提供一种重组载体，其能在家蚕中肠特异表达。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

家蚕中肠特异表达启动子P3的重组载体。

进一步，根据权利要求5所述家蚕中肠特异表达启动子P3的重组载体，所述重组载体为P3-EGFP-SV40片段同基础载体pBac[3×P3-DsRed af]片段连接而得重组载体pBac[P3-EGFP-SV40-3×P3-DsRed af]。

本发明目的之四在于提供所述家蚕中肠特异性启动子的重组载体的构建方法， 该方法操作简单，稳定性好。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述重组载体的构建方法，所述P3-EGFP-SV40片段的构建，具体步骤如下：酶切所述如SEQ ID No:1或如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列，连接用相同内切酶酶切的EGFP-SV40-1180载体，所述EGFP-SV40-1180载体由已含有SV40片段的pSLfa1180fa与pBac[3×P3-EGFP afm]中EGFP绿色荧光蛋白构建，得中间载体P3-EGFP-SV40-1180，所得中间载体P3-EGFP-SV40-1180用限制性内切酶AscⅠ酶切，得P3-EGFP-SV40片段。