[发明专利]利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子检测肝素含量的方法

说明书

技术领域

本发明属于肝素的检测领域，特别是涉及一种利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子检测肝素含量的方法。

背景技术

肝素(heparin)是由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖通过糖苷键连接形成的重复二糖单元组成的一种糖胺聚糖，是蛋白多糖的一种。作为有效的抗凝剂，肝素能抑制血小板聚集，刺激血管内皮细胞释放抗凝物质和纤溶物质，抑制凝血酶的形成及活性，并能促使纤维蛋白溶解。因此是临床上常用的抗凝血药物，主要用于外科预防血栓形成以及妊娠者的抗凝血治疗，以及在心脏手术和肾脏透析时维持血液体外循环畅通。但当肝素用量过大时会引起自发性出血，如各种黏膜出血、关节腔积血和伤口出血等，在临床应用中需要进行实时监控。因此，研究肝素的定量测定方法具有十分重要的临床意义。肝素的常用测量方法主要有电化学分析法、分光光度法、荧光法、区带毛细管电泳法、高效液相色谱法及比色法等。电化学方法则易受到溶液中氧气的干扰，分光光度法灵敏度不高，荧光法容易产生光漂白问题，影响测定的准确性，毛细管电泳法和高效液相色谱法需要昂贵的仪器，操作不便，而比色法主要是基于纳米粒子与肝素作用改变纳米颗粒的大小，导致纳米粒子的光信号改变，并可通过肉眼检测颜色的变化，具有简单，快速，灵敏度高的优点。

贵重金属纳米粒子(NPs)，如Au NPs和Ag NPs由于其表面等离子共振吸收峰而具有独特的光学性能，在医学领域的应用引起了相当大的关注，尤其是在生物传感、疾病诊断、光热疗法以及药物和基因传递领域。在众多的以聚合物辅助合成的Au NPs的实例中，以聚乙烯亚胺(PEI)为稳定剂和还原剂通过原位自动还原的方法合成的纳米粒子已经引起人们大量的关注。这主要是由于聚乙烯亚胺价廉易得，并且利用其分子结构中大量的氨基还原金纳米颗粒可以避免硼氢化钠等还原剂的使用，同时也不涉及高温高压的反应条件，是一种简便、绿色的金纳米颗粒的制备方法。

查阅相关文献，目前还未见利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子来检测肝素含量的方法的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子检测肝素含量的方法，该方法简单，反应条件温和，易于操作，低能耗无污染，符合绿色化学的要求，同时所用金纳米颗粒的稳定剂为聚乙烯亚胺，价廉易得，具有产业化实施的前景。

本发明的一种利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子检测肝素含量的方法，包括：

(1)在100-200μL聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中，加入2.9mL pH值为3.6的醋酸盐缓冲溶液，室温放置15min后测试其紫外吸收曲线；

(2)在n份与步骤(1)中相同体积的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中，分别加入2.9mL含有不同浓度肝素的醋酸盐缓冲溶液，得到n份含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液；其中每份含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中肝素的浓度为0.5-15μg/mL，20≤n≤80；

(3)将步骤(2)得到的n份含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液，在室温下放置15min后，分别测试其紫外吸收曲线；

(4)根据步骤(1)和(3)中所得到的紫外吸收曲线，得出步骤(2)中所述的含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中肝素的浓度和紫外吸收曲线中670nm处吸收值与529nm处吸收值的比值的关系；

(5)测试肝素样品：将90-330μg的肝素样品溶解在29ml醋酸盐缓冲液中，加入1ml聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液，室温放置15min，测试其紫外吸收曲线；然后计算肝素样品的紫外吸收曲线中670nm处吸收值与529nm处吸收值的比值，利用步骤(4)中所述的肝素的浓度和紫外吸收曲线中670nm处吸收值与529nm处吸收值的比值的关系确定肝素样品中肝素的浓度。

步骤(1)和(2)中所述的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液的制备方法为：称取聚乙烯亚胺3-6mg，溶解在10mL水中，然后边搅拌边滴加100-200μL浓度为48.6mg/mL氯金酸溶液，反应2-6天，得到聚乙烯亚胺稳定化金纳米颗粒的水溶液，随后将该水溶液置于4℃冰箱中冷藏备用。

上述的聚乙烯亚胺为超支化聚乙烯亚胺。

上述的氯金酸与聚乙烯亚胺的质量比为1.62∶1。

上述的反应2-6天中的反应温度为25-37℃，随着反应温度的升高，反应时间会有所缩短，同时温度太低不利于金纳米颗粒的形成，温度太高会使产生的金纳米颗粒不够稳定，最后产物为酒红色纳米金的水溶液。