[发明专利]检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测氯霉素的酶联免疫试剂盒，其特别适于动物组织(肌肉、肝脏等)、熟食、水产、蜂王浆、尿液、饲料和牛奶等样本中氯霉素残留的检测。

技术背景

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是20世纪中叶发现的一种广谱抗生素，对革兰氏阴性菌和阳性菌均有很好的抑制作用，由于其优良的抗菌性、稳定的药性和低廉的价格，曾在一段时期内作为细菌性疾病的治疗药物应用于人和动物临床，并作为饲料添加剂广泛应用于畜牧业生产。然而，在使用中人们发现氯霉素具有毒性，在动物性食品中的残留会通过肉、蛋、奶等动物性食品对人的健康产生毒害作用。因此，我国农业部公告第235号文件规定，氯霉素及其盐、酯(包括琥珀氯霉素)在所有食品动物的所有可食组织中不得检出。但由于氯霉素的抑菌效果好，价格低，仍有人将其用于家禽、畜类、水产品中。为了保障人民的身体健康以及扩大食品的贸易往来，建立灵敏度高、特异性强、快速、经济的氯霉素残留检测方法是很有必要的。

目前，用来检测氯霉素的最常用方法主要是气相色谱、液相色谱及色谱-质谱法，这些方法虽然具有灵敏度高、结果准确、重复性好、假阳性少等优点，但仍存在一定缺点，如样品前处理过程复杂，仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，已逐渐不能满足发达国家及食品加工企业对检测方法检测限的要求。与之相比，免疫学测定方法灵敏度较高、特异性强、试样预处理简单、分析时间短，适合现场监控和大量样本的筛查。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足提供一种用于氯霉素检测的酶联免疫试剂盒，其操作简单，适合现场大批量样品的筛选。

本发明试剂盒，它含有：

(1)包被有包被原的酶标板；

(2)酶标记物；

(3)氯霉素标准品溶液；

(4)底物显色液；

(5)终止液；

(6)浓缩洗涤液；

(7)浓缩复溶液。

本发明所提供的检测氯霉素的酶联免疫试剂盒，包括预包被包被原的酶标板和酶标记物工作液；所述包被原为氯霉素抗原、抗体或抗抗体，所述酶标记物为酶标记氯霉素半抗原、酶标记氯霉素抗体或酶标记抗抗体，当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时还含有氯霉素特异性抗体工作液。

所述氯霉素半抗原是将氯霉素分子结构中的硝基通过催化加氢反应得到的。

所述氯霉素特异性抗体为氯霉素单克隆抗体；所述氯霉素单克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，优选为氯霉素鼠单克隆抗体；所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。

以上抗体均可以用氯霉素半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原制备。所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白(BCG)、牛血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白和纤维蛋白原等常用载体蛋白；所述氯霉素半抗原与载体蛋白的偶联物可通过将氯霉素半抗原和载体蛋白用戊二醛法进行偶联得到。

所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记的羊抗鼠抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的；酶标记氯霉素半抗原是采用重氮化法或戊二醛法将标记酶与氯霉素半抗原偶联得到的；酶标记特异性抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与特异性抗体偶联得到的，辣根过氧化物酶可采用现有技术中的多种方法将其与抗抗体进行偶联，如戊二醛法、过碘酸钠法等，本发明经过长期的劳动创造将过碘酸钠法进行了改良，使其省时、降低辣根过氧化物酶(HRP)与抗抗体的浓度比率，节省了原材料。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括氯霉素标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。

所述氯霉素标准品溶液：6瓶，浓度分别为0μg/L、0.025μg/L、0.075μg/L、0.3μg/L、1.2μg/L、4.8μg/L。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由显色液A液和显色液B液组成，A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。

所述浓缩洗涤液优选为pH值为7.1～7.5，含有0.8％～1.2％吐温-20、0.01‰～0.03‰硫柳汞防腐剂、0.01～0.03mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。