[发明专利]一种检测沙丁胺醇药物的胶体金试纸卡及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测沙丁胺醇药物的胶体金试纸卡及检测方法。

背景技术

沙丁胺醇是一种强效选择性β-受体兴奋剂药物，临床上常用于治疗支气管哮喘、哮喘性支气管炎和肺气肿患者的支气管痉挛等呼吸系统疾病。因此药可以提高瘦肉率，减少脂肪沉积和促进动物生长，被一些畜牧养殖企业作为养殖促进剂非法使用。其残留量可导致人体肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、战栗等症状，对消费者的健康极有危害，我国农业部发布的《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》明确规定沙丁胺醇等β-兴奋剂被禁止所有用途，禁用所有食品动物。

目前，对于沙丁胺醇的残留检测主要有高效液相色谱法、液相色谱～质谱联用分析法、气相色谱法、毛细管区带电泳法、免疫测定法等检测方法，仪器检测方法具有检测精确度高的优点，但其仪器化程度高，样品处理较复杂、检测费用高等，不适合用作大批样品的检测，免疫学检测方法操作简单、快速、灵敏，可同时检测多数样品，是理想的快速筛选手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、成本低的沙丁胺醇药物残留检测胶体金试纸卡及其检测方法。

本发明所提供的检测沙丁胺醇药物残留的胶体金试纸卡，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和PVC底板，所述反应膜上有包被有沙丁胺醇-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体构成的质控线，所述结合物释放垫包被有沙丁胺醇单克隆抗体-胶体金标记物。

上述反应膜上检测线处包被的沙丁胺醇-载体蛋白偶联物由沙丁胺醇半抗原与载体蛋白偶联得到；所述的沙丁胺醇单克隆抗体-胶体金标记物中的沙丁胺醇单克隆抗体由沙丁胺醇-载体蛋白偶联物作为免疫原免疫动物获得；所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到的。

本发明中包被原、免疫原、单克隆抗体的合成过程为：

1.半抗原合成

(1)取1-3g沙丁胺醇，溶入20-50ml DMF中，然后加入10％摩尔当量的TEMPO和10％摩尔当量的四丁基氯化铵，20-50ml 0.5M的NaHCO₃水溶液，室温下搅拌30分钟后，加入1.1-1.5摩尔当量的NCS，室温反应2-5小时后，除去大部分溶剂，乙酸乙酯萃取，洗涤，干燥，除去溶剂后柱层析纯化，得到白色固体，为沙丁胺醇单氧化物。

(2)1-2g步骤(1)所得沙丁胺醇氧化物，溶入20-30ml DMF中，加入2-5摩尔当量的乙二胺，室温至100℃反应5-20小时，除去溶剂，乙醇-水中重结晶，得到白色固体，为沙丁胺醇单氧化物的乙二胺缩合产物，即为沙丁胺醇半抗原。

2.免疫原的合成

(1)取沙丁胺醇半抗原18mg用1.5ml水溶解。

(2)取50％的GA8μl加入(1)中，室温下搅拌反应18h。

(3)取BSA100mg用5.5ml水稀释后加入上述溶液中。

(4)反应24h后加入24mgNaBH4反应2h。

(5)用三蒸水透析48小时，即得免疫原。

3.包被原的合成

(1)取沙丁胺醇半抗原15mg用1.5ml水溶解。

(2)取50％的GA8μl加入(1)中，室温下搅拌反应18h。

(3)取OVA30mg用4.5ml水稀释后加入上述溶液中。

(4)反应24h后加入24mgNaBH4反应2h。

(5)用三蒸水透析48小时，即得包被原。

4.单克隆抗体的制备

动物免疫：沙丁胺醇半抗原与载体蛋白偶联物免疫8-10周龄Bal b/c小鼠。

细胞融合与克隆化：取免疫后的鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂聚乙二醇(PEG)4000的作用下融合，筛选获得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明提供了一种制备上述胶体金试纸卡的方法，主要包括如下步骤：

(1)制备包被有沙丁胺醇单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

(2)制备具有包被有沙丁胺醇-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠IgG构成的质控线的反应膜；

(3)将(1)和(2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样本吸收垫、吸水垫和背衬组装成试纸卡。

具体的说，步骤包括：

1)制备获得沙丁胺醇半抗原；

2)将沙丁胺醇半抗原与载体蛋白偶联，制备沙丁胺醇包被原和免疫原；