[发明专利]一种沙眼衣原体的PCR荧光定量快速检测试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种沙眼衣原体的PCR荧光定量快速检测试剂盒及其方法。

背景技术

沙眼衣原体是一类能通过滤菌器，严格真核细胞内寄生，有独特发育周期的原核细胞型微生物。它能引起沙眼，包涵体包膜炎，泌尿生殖道感染以及性病淋巴肉芽肿。注射沙眼衣原体疫苗后，可以诱发局部特异性免疫，但其保护作用仅能维持1-2年。《伯氏系统手册》(1984)的记载，将沙眼衣原体Chlamydia trachomatis分为3个生物型，即小鼠生物型(biovar mouse)，沙眼生物型(biovar trachoma)和性病淋巴肉芽肿生物型(biovarlymphogranulomavenereum，LGV)，后二者与人类疾病有关。用间接微量免疫荧光试验，沙眼生物型又分A.B.Ba.C.D.Da.E.F.G.H.I.Ia.J.K14个血清型，LGV生物型又有L1.L2.L2a.L34个血清型。沙眼生物变种D～K血清型和沙眼衣原体LGV生物变种可以导致男性非淋球菌性尿道炎.女性宫颈炎.输卵管炎.不孕症等。目前衣原体感染已经成为一个严重的社会问题。一方面衣原体已成为性病中最多见的一种病原体，另一方面是它可出现严重的持续性感染现象。最高可有70％的妇女宫颈炎和50％的男性尿道感染是无症状的携带者，因无自觉症状，这些人在社会上是一个高危的潜在传染源。有学者报道，经衣原体阳性母亲产道出生的婴儿，有50％～70％的机会可以获得衣原体感染。有鉴于此，西方国家法定衣原体感染是一项孕妇产前必查的常规项目。所以提早诊断衣原体感染，对优生优育有着极大的意义。

另外，CT的脂多糖可以诱导TNF-α的产生，刺激吞噬细胞活性，从而导致组织损伤。CT是HIV传播的辅助因子，感染CT的女性发生HIV感染较无CT感染的女性高3～5倍，治疗CT可降低HIV的传播。

作为成人泌尿生殖道的一种常见的寄生微生物，CT可引起人类感染多种疾病。目前已经有多种方法可以利用一定的实验室条件对CT作出及时，准确的诊断。

用宫颈或尿道拭子做衣原体培养是检测衣原体的金标准，特异性可达100％，敏感性为80％～90％。最常用的方法是将样本接种于经过环已米特(放线菌酮)处理的McCoy细胞。培养需要48～72h，用碘染色或吉姆萨染色观察包涵体。

如直接免疫荧光法.酶免疫测定(EIA)等，也是用宫颈或尿道拭子做样本。直接免疫荧光法是通过荧光标记特异抗体直接测定衣原体的脂多糖或主要外膜蛋白抗原，特异性96％～100％，敏感性80％～85％。EIA直接测定衣原体脂多糖抗原，与样本中的其它革兰氏阴性菌脂多糖抗原有交叉反应，敏感性相当于培养法的60％～80％，特异性96％～100％。上述方法若用于尿检时，敏感性只有40％～50％，因此不适用于筛查。

DNA扩增技术包括聚合酶链反应(PCR)和连接酶链反应(LCR)，可以直接检测样本中沙眼衣原体质粒或外膜蛋白的核苷酸序列。RNA扩增法扩增的是衣原体核糖体RNA。可以采取尿样做样本，敏感性94％～100％，特异性98％～100％，可用于筛查试验。目前细胞培养的金标准地位正在被PCR和LCR法所取代。

随着分子生物学的发展，转录介导的扩增试验、酶放大免疫反应、半巢式PCR-微空板杂交法、巢式PCR、实时荧光PCR定量检测等方法都在应用，提高了检测的准确性和敏感性，为临床提供了无创、灵敏、快速的检测手段，可用于筛查试验。

目前，国内主要从事CT核酸检测的研发生产公司多采用荧光PCR方法进行CT-DNA定量检测，该法操作简便，灵敏度高，结果便于分析。华美生物公司采用传统PCR技术先对CT目标基因进行扩增，再将扩增产物结合ELISA方法与固定在酶标板的特异性探针进行杂交，之后采用ELISA法进行显色滴定以进行CT-DNA定量，该法的优点在于不需要添置额外的荧光PCR仪，但该法操作繁琐，易造成操作污染。Roche公司最早推出的产品是电泳法分析扩增产物，尔后，在试剂的技术性上有了很大改进，其最明显的是对产物检测的方法的改进，继其电泳法试剂之后正式推出了基于ELISA原理的PCR试剂盒。目前，又有许多公司在研制基于荧光能量转移原理的CTPCR试剂盒，至此，PCR技术用于沙眼衣原体的检测已经发展到非常成熟的阶段。

发明内容

本发明目的是提供一种适用于临床样本中沙眼衣原体的快速检测的试剂盒，可用于沙眼衣原体感染的辅助诊断及疗效监控。