[发明专利]利用EST序列的冗余性开发辣椒SSR标记及其方法

权利要求书

1.一种辣椒EST-SSR标记，其特征在于，所述的EST-SSR标记的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1-66所示。

2.利用EST序列的冗余性开发辣椒SSR标记的方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)从NCBI数据库中检索并下载辣椒的EST序列；

(2)利用CAP3软件对对辣椒EST序列进行拼接；

(3)对拼接后产生的重叠群(Contig)含有所有冗余的EST序列，在Contig序列比对结果中，用office软件提供的查找功能，以“--”为检索符，查找序列比对结果中的序列缺失部分(gap)，再分析其紧邻的非缺失序列是否具有SSR特征，SSR位点的判断标准为：重复基序长度为2-6bp，重复次数＞2，如没有SSR特征，则放弃该序列；如果有SSR特征，则被认为是一个潜在的多态性EST-SSR位点；

(4)利用拼接所产生一致性序列，设计多态性EST-SSR位点侧翼引物；

(5)从不同基因型的辣椒材料的嫩绿叶片中提取总DNA；

(6)用步骤(4)的侧翼引物分别扩增步骤(5)所述的材料，验证EST-SSR位点的多态性，具有多态性的EST-SSR位点的引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1-66所示；

(7)计算每对引物的多态性信息含量，并对EST-SSR标记进行功能注释；

其中步骤(6)的扩增条件如下：

PCR反应的总体积为10μL，含有1x Buffer，2mM MgCl₂，200μM dNTPs，0.2μM引物，0.5U Taq酶，20ng DNA；

PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，35个循环；72℃5min；12℃保存；

其中步骤(7)的计算公式如下：

PIC=1-Σi=1kPi2]]>

式中：k是一个SSR所检测到的等位基因的数量；

P_l是第i个等位基因的频率。