[发明专利]利用EST序列的冗余性开发辣椒SSR标记及其方法

说明书

技术领域

本发明属于植物分子标记开发技术领域，具体涉及到利用公共序列数据库中EST序列的冗余性开发辣椒SSR标记的方法，所开发的标记可用于辣椒分子标记辅助选择育种等研究。 

背景技术

SSR(simple sequence repeats，简单序列重复)标记因具有数量丰富、多态性高、重复性好、呈共显性遗传等优良特性，而被广泛地应用于高密度连锁图谱的构建、基因定位和分子标记辅助选择等研究。但按照传统的方法，SSR标记的开发需要构建基因组文库和筛选阳性克隆等操作，不仅费时费力而且成本高。 

对于有一定数量DNA序列信息的物种来讲，一个实用、经济和直接的方法是利用已有的DNA序列搜寻SSR位点。 

随着测序技术的发展，全基因组测序的速度越来越快，成本也在逐渐降低，已有一些具有重要经济价值的作物被测序。利用全基因组序列可以开发大量的SSR标记，从而避免传统的SSR标记开发所需的复杂操作(Ren Y，Zhang ZH，Liu JH，Staub JE，Han YH，Cheng ZC，Li XF，Lu  JY，Miao H，Kang HX，Xie BY，GuXF，Wang XW，Du YC，Jin WW，Huang SW.Integrated Genetic and Cytogenetic Map of the Cucumber Genome.Plos One.2009，4(6)：e5795)。但目前仅有一些模式作物和主要的农作物完成了基因组测序，对于大多数农作物而言，尚无全基因组序列可以利用。 

当前，开发SSR标记的另一个序列来源是EST(expressed sequence tags，表达序列标签)。随着功能基因组学的发展，EST被大规模测序，并存放在公共序列数据库中。利用EST序列，采用in silico的方法筛选SSR已经成为一个简单易行的开发SSR标记的方法。目前已开发出多种软件可用于SSR位点的鉴定，极大地提高了SSR标记的开发效率。因此，采用数据挖掘技术，利用公共序列数据库中丰富的EST序列鉴定和开发SSR标记，已经成为当前开发SSR标记的主要方法。 

利用EST序列开发SSR标记的主要障碍是EST序列的冗余性，即在基因组上同一个位点可能产生多个重复的SSR标记。冗余性是EST序列的特征之一，其产生的原因主要是很多EST可能是来自于同一个高丰度表达的基因。因此，为克服EST序列的冗余性，避免同一位点的SSR标记被重复开发，在鉴定SSR位点之前需要对EST序列进行拼接，产生一致的基因序列，即Unigene，然后再基于Unigene来开发SSR标记，则可以克服EST序列冗余性的缺点(Kong Q，Xiang C，Yu Z.2006.Development of EST-SSRs in Cucumis sativusfrom sequence database.Molecular Ecology Notes，6：1234-1236；王长彪等，一种SSR分子标记冗余性的生物信息学分析方法.专利申请号：201010601582.0)。 

目前利用公共序列数据库中的EST开发EST-SSR的一般程序是：获得EST序列，对EST序列进行拼接处理获得Unigene，消除序列冗余性并延长转录片段长度，然后利用SSR位点搜寻软件以一定的标准(通常是5次以上重复)在Unigene上鉴定SSR位点，最后用实验验证SSR位点的多态性(Kong Q，XiangC，Yu Z.2006.Development of EST-SSRs in Cucumis sativus from sequence database.Molecular Ecology Notes，6：1234-1236.)。这一方法虽然可以大量地鉴定出SSR位点，但通常获得的多态性的SSR位点的比率比较低。因为很多基于序列特征被鉴定出来的SSR位点，可能是基因组上特有的序列结构，并不具有SSR的变异性。此外，以往的研究很少去开发5次重复以下的SSR位点。 

公共序列数据库具有开放性的特点，这一特点也使得数据库中的序列来源具有高度异质性，即这些序列是不同实验室、利用不同基因型的材料所获得的，同时，这也是EST序列产生冗余性的原因之一。因此，冗余序列可能含有SSR长度多态性的信息。而这些信息当前都被忽略了，因为SSR鉴定前通常要消除序 列的冗余性。