[发明专利]微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因(Ms-Δ6-FAD)及用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的基因序列，以及这种基因序列的制备方法和用途，确切讲本发明涉及微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶(Ms-Δ6-FAD)基因及其制备与用途。

背景技术

γ-亚麻酸(γ-linolenic acid，GLA)是一种多功能油脂成分。许多研究表明GLA具有多种重要的生理活性作用，它在机体的物质代谢和生理调控上发挥着十分重要的作用：降血脂、抗血栓性心脑血管、预防和治疗高血压、动脉粥样硬化、增强人体的免疫功能，GLA还具有抗革兰氏阴性菌和阳性菌、抗HIV感染、抗肿瘤、抗多种炎症、抗脂质过氧化、抑制溃疡和增强胰岛素和减肥等方面的作用，参见董杰明等“γ-亚麻酸的保健作用”《卫生研究》2003，32(3)：299-301。Δ6-脂肪酸脱氢酶(Δ6-FAD)基因是介导GLA合成的关键酶基因。

发明内容

本发明提供一种取自我国特有物种-微孔草的Δ-6脂肪酸脱氢酶基因，以及这种基因的制备方法及用途，该基因表达可以使低温胁迫下的微孔草积累γ-亚麻酸，在转基因植物中的表达使其产生了新性状。

微孔草(Microula sikkimensis Hemsl.)系紫草科微孔草属，为二年生草本植物，主要分布于陕西西南部、甘肃、青海、四川西部、云南西北部、西藏藏东和南部，参见：中国科学院中国植物志编辑委员会《中国植物志》北京：科学出版社，1990151-175。

本发明所涉及的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因制备方法是：首先提取微孔草的RNA，再反转录为cDNA；利用GenBank中已公布的其它植物的Δ-6脂肪酸脱氢酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物P1、P2；以得到的微孔草cDNA为模板扩增得到微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因核心片段核苷酸序列；根据测序得到的Ms-Δ6-FAD基因核心片段序列分别设计微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因特异引物5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的5’P和5’NP配对，以微孔草cDNA为模板，进行5’外侧和巢式PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同样根据测序得到的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因核心片段序列分别设计微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的3’P和3’NP配对，以微孔草cDNA为模板，进行3’外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端核苷酸序列；根据已克隆到的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因5’和3’末端核苷酸序列，设计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因的全长翻译区核苷酸序列。

在P7、P8引物的5’端分别加入Nco I和Bste II酶切位点序列，便于后期的基因编码区与植物表达载体重组。

实验表明，冷冻胁迫(2℃)进行的96小时期间，微孔草叶片中γ-亚麻酸含量明显上升，低温可以诱导其积累。构建Ms-Δ6-FAD的表达载体，转染烟草后得到的转基因植物产生了新性状：野生型烟草叶片和种子中无γ-亚麻酸，而转基因烟草其含量分别占总脂肪酸的16.3％和4.8％。

据报道，不饱和脂肪酸的增加与植物抗生物(病原体、植物病原体互做等)和非生物胁迫(低温、干旱、盐、重金属等)密切相关，参见：Robert G.Upchurch“Fatty acid unsaturation，mobilization，and regulation in the response of plants to stress”Biotechnol Lett (2008)30：967-977，因此，微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因有可能在这些过程中发挥作用。

采用的相关引物均由大连宝生物合成(宝生物工程有限公司，辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号，邮编116600)，序列如下：

P1：5’-TAYAGSAAGCTTGTGTTTGAG-3’

P2：5’-ARTTCTTSGGGAGCGGCTTGG-3’

P3：5’-CGGAAAGACAATTTGCAAACAGAATACC-3’

P4：5’-TACCCAAACAGACTCAAAAAACAAAACC-3’

5’P为：5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’，

5’NP为：5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’；