[发明专利]低电压瞬时电脉冲构建小球藻生物反应器的方法

权利要求书

1.一种低电压瞬时电脉冲构建小球藻生物反应器的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取处于对数生长期的小球藻，以5％的接种量接种于Knop液体培养基中，25℃下静置培养，光照条件3000～4000lx，每4h摇动一次，连续照明，培养2d；

取上述培养液，离心收集小球藻细胞，重悬于MBBM培养基中，置于光照培养箱中培养，3000～4000lx，25℃下静置培养24h；将培养后的小球藻细胞，加入含有4％(W/V)纤维素酶的pH 6.0的并含有0.3mol/L山梨醇/甘露醇高渗PBS缓冲液中重悬细胞，30℃下，80r/min摇床，黑暗酶解4h，进行处理；

2)取步骤1)处理后的小球藻液，8000rpm离心5min，用Hepes Buffer重悬细胞沉淀，加入携带ble基因的质粒pSP124S DNA，浓度为76.5ng/μl；电击转化小球藻，脉冲电压为500V，脉冲持续时间1.2ms；

3)将藻体于冰上预冷6min，加入到含0.5mol/L蔗糖的Knop液体培养基中，25℃下，光照条件3000～4000lx温和培养24h，然后加至含有0.5mol/L蔗糖，4μg/mL Zeocin的Knop半固体培养基中，混合均匀，涂布于含有0.5mol/L蔗糖，10μg/mL Zeocin的Knop固体培养基上，置于25℃培养箱中，光照条件3000～4000lx静置培养10d。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的MBBM培养基组成：0.5g NH₄Cl，0.075g MgSO₄，0.17g KH₂PO₄，0.075g K₂HPO₄，0.025g CaCl₂，0.025g NaCl，0.05g酵母粉，1mLA6混合液，7.5g 2DG，3.75g葡萄糖，用dH₂O定容到1L，pH 7.0；A6混合液：0.28gH₃BO₃，0.25g MnSO₄·7H₂O，0.0222g ZnSO₄·7H₂O，0.0079g CuSO₄·5H₂O，0.0021gNa₂MoO₄·2H₂O，100ml dH₂O。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的Knop液体培养基组成：每升Knop培养基中含有：葡萄糖3g，酵母粉3g，KH₂PO₄0.025g，Ca(NO₃)₂0.1g，MgSO₄0.025g，KCl0.012g，FeCl₃0.001g。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的Hepes Buffer组成：1mol/L NaCl，0.01mol/L KCl，0.01mol/L CaCl₂，0.02mol/L Hepes，0.2mol/L甘露醇，0.2mol/L山梨醇。