[发明专利]低电压瞬时电脉冲构建小球藻生物反应器的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种低电压瞬时电脉冲构建小球藻生物反应器的方法。它是一种条件温和，低成本，便捷的使外源基因安全地进入小球藻细胞的新方法。在生物技术领域可以建立小球藻生物反应器，对于生产高附加值产品，特别是来源紧俏的基因工程产品具有广泛应用前景。

背景技术：

椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)为绿藻门小球藻属单细胞真核藻类，是一种重要的绿色微藻资源。在具有体积小，繁殖迅速，易于培养等特点的同时还含有叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素，能够利用光能进行光合作用，培养成本低廉。小球藻是一种优质的蛋白质资源，被联合国粮食及农业组织(FAO)列为二十一世纪人类的绿色营养源健康食品。小球藻具有真正的细胞核，对于一些需要大量生产而又对原核表达生物有害的物质或表达需要翻译修饰的复杂蛋白，可利用小球藻生物反应器来生产。小球藻不含内毒素，利用转基因技术将小球藻改造成新型高效的生物反应器，对于生产高价值产品，特别是来源紧俏的医药产品具有广泛应用前景。

Maruyama认为：在高场强及长时间的电脉冲持续期，小球藻细胞可得到高的通透性，吸纳外源DNA的能力较强。Maruyama等以小球藻(C.saccharophila)为受体，采用高压电击法，在600-900V电场强度，400ms脉冲持续时间的条件下，将质粒pBI221导入藻细胞(Maruyama M et al.，1994)。王逸云等在5000V脉冲电压，50ms脉冲持续时间，脉冲次数为2¹¹次，循环次数为90次的高强度电场力条件下，将质粒pBI121/phyA II转入藻细胞(王逸云，2005)。张小宇等在6000-9000V脉冲电压，20-50ms脉冲持续时间，脉冲次数为2¹⁰条件下，将兔防御素基因NP-1转入藻细胞，获得了稳定表达外源蛋白质的小球藻生物反应器(张小宇，2006)。

虽然以上报道成功地将外源基因转入小球藻，但是他们的方法均存在着缺点与不足。首先，高强度或长时间持续电脉冲损伤小球藻细胞；其次，实现上述高电压及长时间脉冲刺激等实验条件，必需具有高性能的电转化仪和基因枪等价格昂贵的设备，增加了实验成本。因此，寻找一种比较温和、低成本、便捷的使外源基因安全地转入小球藻细胞的新方法非常有必要。

发明内容：

本发明的目的在于提供了一种低电压瞬时电脉冲构建小球藻生物反应器的方法。本发明首先获得了具有高通透性细胞壁的活体小球藻，利用低电压及瞬时电脉冲的条件，将基因载体及外源基因导入活体小球藻，避免了转化藻体时高强度电压或长时间电脉冲对小球藻的损伤，从而使外源基因平稳地进入小球藻细胞，建立小球藻生物反应器。本发明利用较温和的低电压瞬时电脉冲电击转化法成功地构建了小球藻生物反应器。

本发明提供的小球藻生物反应器的构建方法包括的步骤如下：

1)取处于对数生长期的小球藻，以5％的接种量接种于Knop液体培养基中，25℃下静置培养，光照条件3000～4000lx，每4h摇动一次，连续照明，培养2d；

Knop液体培养基(pH 7.0)：葡萄糖3g；酵母粉3g；KH₂PO₄0.025g；Ca(NO₃)₂0.1g；MgSO₄0.025g；KCl 0.012g；FeCl₃0.001g；dH₂O 1 L。

取上述培养液1ml，离心收集小球藻细胞，重悬于1ml MBBM培养基中，置于光照培养箱中培养，3000～4000lx，25℃下静置培养24h；