[发明专利]一条编码ADI的优化DNA分子及表达ADI的工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及一条编码ADI的优化DNA分子及含有所述优化DNA分子的工程菌，属于生物技术领域。

背景技术

L-精氨酸是哺乳动物细胞很重要的营养物质，它也被支原体用作主要的非糖酵解能量来源。从被支原体感染的细胞培养物中得到的精氨酸脱亚胺酶(Aiginine deiminase，ADI，EC 3.5.3.6)能够降解精氨酸为瓜氨酸和氨水，该酶存在于很多种类的微生物中，ADI已被证明能够抑制肿瘤细胞体外生长以及具有抗血管生成的活性。

人体正常细胞能够通过瓜氨酸透过胞质酵素精氨基琥珀酸合成酶（ASS）及精氨基琥珀酸裂解酶（ASL）合成精氨酸。精氨酸的代谢途径已被很好地描述，在膳食摄取中，精氨酸从肝门静脉被肝吸收，并通过精氨酸酶迅速转化为鸟氨酸，在后一过程中，形成尿素，从精氨酸产生的鸟氨酸然后转化为瓜氨酸，或者可被代谢为谷氨酸盐/酯和丙氨酸，或者形成的鸟氨酸掺入多胺化合物，例如，腐胺。未被代谢为鸟氨酸的膳食精氨酸可被加工为例如精氨酰-tRNA，用于蛋白合成。此外，存在通向精氨酸的内源合成途径，后一过程主要在肾脏中发生，其中从鸟氨酸和瓜氨酸前体合成精氨酸。

人形支原体M. arginini的ADI是一种能够降解精氨酸的酶，其由arcA基因编码，蛋白总量占M. arginini可溶蛋白的10%，除了支原体M. arginini以外，其它许多微生物如Mycoplasma hominis、Mycoplasma arthritidis、Mycobacterium tuberculosis、Lymedisease spirochetes和Streptococcus等都编码ADI，后者催化精氨酸代谢为生物体提供能量。M. arginini编码的ADI是由410个氨基酸组成的球型生物大分子，分子量约为46000，等电点为4.7，没有分子内二硫键，以二聚体形式出现。

氨基酸降解酶能通过解除胞外相关氨基酸的供给来抑制某些肿瘤细胞的增殖。人体部分肿瘤细胞缺乏精氨酸合成的相关酶，不能合成精氨酸（Cancer Res 62:5443-5440)，属于精氨酸营养缺陷型肿瘤细胞，这种不能表达精氨基琥珀酸合成酶的性质最近被科研人员所证实(Shen L J, Lin W C, Beloussow K, Shen W C. 2003)。肝癌、乳腺癌、黑素瘤等肿瘤是人体常见肿瘤，研究表明，这些肿瘤多是精氨酸营养缺陷型，这些肿瘤的细胞往往不能合成精氨酸，必须依赖外界的精氨酸来维持细胞的生长繁殖，而人体正常细胞是能够自身合成精氨酸的。因此，通过ADI降解血液循环中的精氨酸，精氨酸的营养缺陷导致肿瘤细胞增殖受到抑制，进而达到治疗肿瘤的效果。

ADI能有效抑制精氨酸缺陷型肿瘤，如黑素瘤和肝细胞癌(HCC)的增殖。同时，ADI还能诱使人类白血病细胞的凋亡，抑制内皮细胞血管增生。1970年，Gill等人最先报道了从支原体分离得到的ADI能抑制小鼠淋巴瘤L5178Y细胞的分裂（Gill P, Pan J, 1970,16(6):415—419）。小鼠体内研究表明，ADI注射在抑制黑素瘤和HCC实验鼠中是有效的（Takaku H, Takase M, 1992,51(2):244—249）。然而，ADI用作常规抗肿瘤药物却因其低效性而受到限制，而这是由ADI作为一种微生物活性酶，在哺乳动物中具强抑制内皮细胞生长活性和较短的血清半衰期引起的。经20 KD PEG修饰ADI-PEG-20（ADI-SS PEG20,00 mw）和天然ADI在体外对黑素瘤和HCC细胞一样有效。1999年ADI-PEG-20，即PEG化重组支原体ADI被FDA指定为美国罕见病药物，用于治疗恶性黑素瘤和HCC。目前正在全球范围进行治疗黑色素瘤和原发性肝癌的II期和III期临床试验。