[发明专利]ITR同向排列的AAV载体构建及其应用

说明书

本发明属于生物技术发明领域。本发明具体涉及一种ITR同向排列的AAV载体pSDAV2，该表达载体主要由两个同向排列的AAV2的ITR、筛选基因表达框和外源基因表达框组成，其中外源基因表达框中含有多克隆位点MCS，用于表达外源基因的插入。将报告基因插入pSDAV2载体，筛选获得细胞株，利用“一个细胞株/一株辅助病毒”策略包装重组AAV病毒，发现ITR同向排列不仅能够明显提高包装获得重组AAV病毒中双链AAV病毒的比例，还能增强包装携带基因的体内外表达效率。总之，本发明提出并构建了一种ITR同向排列的AAV载体，为重组AAV病毒的包装特别是重组双链AAV病毒的包装提供了新的选择。

背景

腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)属于微小病毒科(Parvovirus)，其基因组为一条单链DNA分子。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒，或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态，而不产生子代病毒。

目前已发现多种AAV病毒，从基因组组成和血清学上可以分为不同的亚型(Wu ZJ，Asokan A，Samulski RJ.Adenoassociated virus serotypes：vector toolkit for human gene therapy.Mol Ther，2006，14(3)：316-327.)。虽然不同的基因组亚型之间，核苷酸序列存在一定的差异，但不同亚型之间的基因组大小和结构是相似的。以AAV2为例，其基因组大小为4675nt，分为反向末端重复序列(Inverted terminal repeat，ITR)区、rep基因区和cap基因区。ITR区为基因组5’和3’末端两个长度为145nt的反向末端重复序列，包含AAV2基因组的复制起点，与AAV2复制、整合或包装等功能相关，为AAV2病毒基因组中的顺式作用元件。rep基因区和cap基因区为两个功能基因区，编码AAV2生活周期中需要的各种调节蛋白和结构蛋白，为AAV2产毒性复制提供各种反式作用因子。rep基因区编码AAV复制和病毒基因表达等所必需的调节蛋白，根据分子量大小的不同可分为：Rep78、Rep68、Rep52、Rep40等4种形式。cap基因区编码3种结构蛋白，VP1、VP2、VP3，共同组装成AAV病毒的外壳。

AAV是基因治疗的理想载体之一。大量的高质量的重组AAV(Recombinant AAV，rAAV)病毒的制备是AAV载体用于基因治疗的前提和基础。rAAV病毒制备的过程中主要解决的3个问题是，AAV载体质粒的设计和构建，各种反式作用因子(即rep和cap基因编码的各种蛋白)的反式提供和辅助病毒的选择和提供。针对这3个问题，不同的研究者提出了不同的解决方案，形成了多种rAAV病毒的制备系统。目前国际上普遍采用的是Xiao(Xiao X，Li J，Samulski RJ.Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.J Virol，1998，72(3)：2224-2232.)等提出的三质粒共转染系统。这三个质粒分别为AAV载体质粒，rep-cap表达质粒和辅助质粒。三个质粒分别解决rAAV病毒制备过程中的3个问题。AAV载体质粒包含AAV2的两个ITR序列，且在两个ITR之间插入外源启动子、多克隆位点和polyA加尾信号序列，用于外源表达基因的克隆。rep-cap表达质粒通过编码和表达AAV病毒产毒性复制的各种调节蛋白和结构蛋白，反式提供rAAV病毒包装过程中所需的各种因子。辅助质粒携带了5型腺病毒的E2A、E4ORF6和VA RNA基因，可替代腺病毒，为rAAV病毒的产毒性复制提供辅助功能。在国内rAAV病毒制备应用较为广泛的方法为两个中国专利(专利号：98120033.8，99119038.6)组合报道的“一种病毒感染一个载体细胞株”法系统。专利(专利号：98120033.8)报道了一种携带rep-cap基因表达框的1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 1，HSV1)，这株病毒不仅具有辅助病毒的功能，还可以反式提供各种rAAV病毒产毒性复制所需的各种反式作用因子。专利(专利号：99119038.6)则报道了一系列通用型腺相关病毒载体，应用这些载体可以构建稳定携带AAV载体的细胞株，将专利(专利号：98120033.8)中的辅助病毒感染AAV载体细胞株，制备获得大量的rAAV病毒。