[发明专利]一种分析基因表达定量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及核酸测序技术领域，特别是RNA-seq技术领域以及测序后信息分析的方法。

背景技术

目前，基因表达定量研究领域主要有两种技术：传统的芯片技术和测序技术。其中，芯片技术通量高，自动化，成本低，但是芯片技术依赖于已知基因，信号噪音高，重复性差，检测阈值窄；测序技术又分为SAGE，数字基因表达谱（Digital Gene Expression，DGE）和数字基因表达谱升级版RNA-Seq(Quantification)技术，其中，SAGE技术测序准确，但操作繁琐，测序成本高。基于第二代高通量测序平台的DGE和RNA-Seq技术克服了芯片技术和SAGE技术的缺点，它们通量高，自动化，测序成本低，噪音小，不依赖于已知基因，检测阈值宽。

但是DGE由于实验本身的局限性，导致了该项技术不能够检测到不含CATG位点的基因，并且DGE技术在研究基因表达定量时对参考基因的依赖性很强，对于一些非模式生物的定量分析也存在一定的局限性。

以illumina测序平台为代表的第二代高通量测序技术不仅节省了大量的人力和物力，而且还具有测序通量高、准确度高和成本低的众多优点。目前该平台已经广泛应用于：全基因组测序，新物种测序，目标基因组测序，转录组和表观遗传分析等领域。

随着第二代高通量illumina测序平台的广泛应用，多物种基因组测序和全基因组研究的大规模开展，降低测序成本，减少测序流程，提高劳动效率成为测序技术的一个重要研究方向。而基于illumina测序平台RNA-seq的基因表达分析存在步骤多，成本高，操作过程繁琐，不适合用于自动化工作站等缺点。

发明内容

本发明的一个方面提供了一种分析基因表达定量的方法，包括：

（1）从总RNA中纯化mRNA，制备片段化mRNA；

（2）将所述片段化mRNA逆转录制备得到cDNA，将所述cDNA纯化后制备为平末端DNA，纯化平末端DNA；

（3）将所述平末端DNA的末端加“A”碱基，得到末端加“A”碱基的DNA；

（4）在末端加“A”碱基的DNA两端加接头序列，纯化两端加接头序列的DNA进行PCR反应，纯化PCR反应产物；

（5）对所述PCR反应产物测序；

（6）将测序得到的数据过滤不合格序列得到干净序列，将所述干净序列与参考序列比对，对比对结果进行分析。

在本发明的一个实施方案中，所述的总RNA的选取量为0.1μg～2μg。

在本发明的一个实施方案中，使用Invitrogen公司生产的Oligo（dT）₂₅(产品号610.06)磁珠从总RNA中纯化mRNA。

在本发明的一个实施方案中，使用Beckman公司生产的Ampure XP磁珠（产品号A63882）纯化所述cDNA、两端加接头的DNA片段、PCR反应产物。

在本发明的一个实施方案中，使用试剂Ⅰ制备片段化mRNA，所述试剂Ⅰ含有： 10-400mM可溶性盐，200mM-300mM缓冲盐，pH 8.0-8.5，溶剂为水；优选地，试剂Ⅰ中缓冲盐选自Tris-HCl、磷酸盐。优选地，试剂Ⅰ中可溶性盐选自氯化钠，氯化镁。优选地，mRNA与试剂Ⅰ混合温度为65℃～94℃。

在本发明的一个实施方案中，使用试剂Ⅱ对cDNA进行末端修复，得到平末端DNA，所述试剂Ⅱ含有：1.2uLT4 DNA 聚合酶(3U/μL)，1.2uLT4多聚核苷酸激酶(10U/μL),0.2ulKlenow DNA 聚合酶(5U/μL),0.4uL 25mM dNTP；T4多聚核苷酸激酶缓冲液含有700 mM Tris-HCl，100 mM氯化镁，50 mM DTT。

在本发明的一个实施方案中，使用试剂Ⅲ对所述平末端DNA的末端加“A”碱基，所述试剂含有：100 mM -500mM 可溶性盐，100 mM 缓冲盐，10mM -50mM 二硫苏糖醇，5mM dATP，0.2μL Klenow(3＇-5＇exo)酶(5U/μL)，pH7.6-7.9，溶剂是水。优选地，试剂Ⅲ中缓冲盐选自Tris-HCl、磷酸盐。优选地，试剂Ⅲ中可溶性盐为氯化钠。优选地，样品与试剂Ⅲ混合温度为16℃-37℃。