[发明专利]金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR的检测试剂盒和试剂盒使用方法

权利要求书

1.一种金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR检测试剂盒，其特征是包括有：10× PCR buffer 5uL，dNTPs  2 .5mmo l/L 2uL，Taq DNA 聚合酶 5U /L 0 . 25uL，正向引物 10p mo l/L 2uL，引物5＇-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3＇；反向引物 10p mo l/L 2uL，引物5＇-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3＇；双蒸水99%～100%；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阳性对照PCR管为灭活的金黄色葡萄球菌菌液1管；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阴性对照PCR管为灭菌的PBS阳性对照1管；阴性对照1管。

2.一种金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是，所述使用方法的步骤为：

（1）加样品孵育3小时，抗体会特异性捕捉和富集样品中的金黄色葡萄球菌病菌；

（2）PCR扩增，其扩增条件是： 99 ^oC高温裂解细菌10min，释放DNA 作为扩增模板；再加入10× PCR buffer 5uL，dNTPs  2 .5mmo l/L 2uL，Taq DNA 聚合酶 5U /L 0 . 25uL，正向引物 10p mo l/L 2uL，引物5＇-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3＇；反向引物 10p mo l/L 2uL，引物5＇-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3＇；双蒸水99%～100%；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的检测PCR管；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阳性对照PCR管为灭活的金黄色葡萄球菌菌液；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阴性对照PCR管为灭菌的PBS；PCR扩增条件：94^oC 2m in ; 94 ^oC 1min , 61 ^oC 30 s ,72 ^oC 1min30s , 35 个循环; 72 ^oC 3 m i n30s ,最后4℃保持；

（3）1-1.5%琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析；

（4）对条带进行分析得出结论；若有279bp扩增条带，则判断为金黄色葡萄球菌。

3.如权利要求2所述的金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是，所述的包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的检测PCR管的具体步骤为：

用包被缓冲液按照1：1000-1500稀释金黄色葡萄球菌多克隆抗体，抗体浓度为1.0-1.3ug/ml，将稀释好的抗体按照每管50μL加入PCR管室温4小时或4℃过夜包被抗体；

包被缓冲液配方为：碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93 g，叠氮化钠0.2 g，溶于1000ml PBST缓冲液中，调pH值到9.6；配制PBST：氯化钠8.0 g，无水磷酸氢二钠1.15 g，无水磷酸二氢钾0.2 g，氯化钾0.2 g，吐温-20 0.5 毫升，加双蒸水到1000ml，调pH值到7.4。

4.如权利要求2所述的金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是，所述的加样品孵育3小时，抗体会特异性捕捉和富集样品中的金黄色葡萄球菌的具体步骤为：

a) 样品制备方法为：按国标GB/T4789.10-2008《食品卫生微生物学检验——金黄色葡萄球菌检验法》取25g样品加入225ml磷酸盐缓冲液，作为食品匀浆，然后对匀浆液人工污染不同浓度的金黄色葡萄球菌，人工污染的匀浆液中金黄色葡萄球菌的浓度依次为10⁷-10⁰cfu/ml；

b)磷酸盐缓冲液配方为： 磷酸二氢钾34g, 蒸馏水500ml，PH 7.2，作为贮存液存于4⁰C，每次用时取1.25ml蒸馏水稀释至1000ml,121⁰C高压灭菌15min。

5. 一种金黄色葡萄球菌快速免疫捕捉PCR检测试剂盒模板DNA快速获取方法，其特征步骤为：

取检测样品50ul置于已经包被好金黄色葡萄球菌特异性抗体的PCR管中，37⁰C放置3h或4⁰C过夜，37⁰C孵育3h,用移液器小心吸去检测样品，然后再用PBST洗涤离心管3次，每次2Min，扣干残液，加入33.75ul双蒸水，将处理液于PCR仪上以99℃裂解10min，然后迅速转移到冰上冷却5min,再经5000r/min离心2min后,其上清液即为可用于PCR扩增的DNA。