[发明专利]金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR的检测试剂盒和试剂盒使用方法

说明书

技术领域

本发明是一种金黄色葡萄球菌的基因检测试剂盒，属于食源性致病菌的检测领域，专一针对金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus,SA）的检测。适用于食品中金黄色葡萄球菌的快速检测。

背景技术

 金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus，SA) 是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，可引起多种严重感染。有“嗜肉菌的别称。典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH 7.4,干燥环境下可存活数周。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。对碱性染料敏感，十万分之一的龙胆紫液即可抑制其生长。

食源性致病菌是影响食品安全的主要原因之一,检测食源性致病菌是食源性疾病预防与控制的关键环节。传统的检测方法如分离培养、 生化鉴定等5-7d的时间，而且存在特异性不高、 灵敏度低、 操作烦琐耗时, 不能实现及时有效的监测。因此,发展新的快速检测与鉴定食源性致病菌的方法为及时有效地控制和预防致病菌传播所必需。近年来,随着PCR 技术的广泛应用,国内外已经将这一技术引入食源性致病菌检测领域。发展一种将病原富集和基因水平检测有效结合的方法，是金黄色葡萄球菌检测急需解决的问题。

发明内容

 本发明的目的在于避免现有技术的不足提供一种金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR检测试剂盒。以克服现有的食源性致病菌检测方法灵敏性低、特异性差、费时不稳定的不足，将病原富集和基因水平检测有效结合的方法，用免疫学方法先将样品中的病原富集，然后进行PCR扩增，可以极大的提高检测灵敏度，同时大大提高了检测的效率。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR检测试剂盒，其主要特点是包括有：10× PCR buffer 5uL，dNTPs  2 .5mmo l/L 2uL，Taq DNA 聚合酶 5U /L 0 . 25uL，正向引物 10p mo l/L 2uL，引物5＇-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3＇；反向引物 10p mo l/L 2uL，引物5＇-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3＇；双蒸水99%～100%；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的检测PCR管；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阳性对照PCR管（灭活的金黄色葡萄球菌菌液）；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阴性对照PCR管（灭菌的PBS）；阳性对照1管；阴性对照1管。

一种金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR检测试剂盒的使用方法，其主要特点是，所述使用方法的步骤为：

（1）加样品孵育3小时，抗体会特异性捕捉和富集样品中的金黄色葡萄球菌病菌；

（2）PCR扩增，其扩增条件是： 99 ^oC高温裂解细菌10min，释放DNA 作为扩增模板；再加入10× PCR buffer 5uL，dNTPs  2 .5mmo l/L 2uL，Taq DNA 聚合酶 5U /L 0 . 25uL，正向引物 10p mo l/L 2uL，引物5＇-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3＇；反向引物 10p mo l/L 2uL，引物5＇-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3＇；双蒸水99%～100%；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的检测PCR管；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阳性对照PCR管（灭活的金黄色葡萄球菌菌液）；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阴性对照PCR管（灭菌的PBS）；PCR扩增条件：94^oC 2m in ; 94 ^oC 1min , 61 ^oC 30 s ,72 ^oC 1min30s , 35 个循环; 72 ^oC 3 m i n30s ,最后4℃保持。

（3）1-1.5%琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析；