[发明专利]融合有V5标签重组蛋白的ELISA定量检测试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体是涉及一种融合有V5标签重组蛋白的ELISA定量检测试剂盒和方法。

背景技术

目前，在重组蛋白的表达中，为了便于重组蛋白的鉴定分析，常常在蛋白中融合一个“蛋白标签”，如：6×His tag、V5 tag、GFP tag、GST tag、flag tag、c-myc tag等。在常见的真核表达载体中，常用的标签有：6×His tag、V5tag和GFP tag。与6×组氨酸标签相比，V5 tags在真核蛋白的鉴定分析中具有更好的特异性，由于只有14个氨基酸，V5标签的插入几乎对重组蛋白的结构没有影响。

标签多肽的使用使本领域的技术人员可以应用商品化的标签抗体快速地鉴定出外源蛋白的表达情况。到目前为止，标签蛋白及其抗体大多使用在对目的蛋白的定性分析中，很少用于对目的蛋白的定量分析。本发明建立了一种对溶液中融合有V5标签重组蛋白的通用、快速、简便、准确的定量方法，并且提供了应用本检测方法测定目的蛋白的一套试剂系统；与较多使用的“双抗夹心法”相比，“竞争法”只用一种商业化抗便可完成对目的蛋白的定量分析。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种融合有V5标签重组蛋白的ELISA定量检测试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下：

一种融有V5标签蛋白的ELISA定量检测试剂盒，其包括有：

(A)包被有V5多肽的微孔板，每个微孔包被100μL的V5多肽，V5多肽的浓度为0.015μg/mL-2μg/mL；

(B)1mg/mL的抗-V5多肽单克隆抗体的工作浓度的稀释比例为：1∶500-64000，用量为每微孔100μL。

本发明的另一目的是提供一种融有V5标签的蛋白的ELISA检测方法。

实现上述目的的技术方案如下：

一种融有V5标签的蛋白的检测方法，包括以下步骤：

(1)用待测样品对抗-V5多肽单克隆抗体进行稀释，得混合液，抗-V5多肽单克隆抗体(1mg/mL)的稀释比例为：1∶500-64000；混合液4℃孵育过夜；

(2)在包被有V5多肽的微孔板中每孔加入100μL上述混合液，37℃孵育0.8-1.2小时；所述微孔板每孔包被V5多肽100μL，V5多肽的浓度范围为0.015μg/mL-2μg/mL；

(3)清洗，每孔加入羊抗鼠IgG-HRP抗体，37℃孵育；清洗后加入TMB底物溶液显色；

(4)于各反应孔中加入终止液反应，在酶标仪450nm波长下检测OD值。

优选地，所述V5多肽的浓度为0.125μg/mL-0.5μg/mL，最优选为0.25μg/mL；所述抗-V5多肽单克隆抗体的工作浓度为0.25-1μg/mL，最优选的工作浓度为0.5μg/mL。

本发明的有益效果如下：

(1)与“双抗夹心法”相比，仅使用V5多肽标准品及其商品化抗体便可实现对液体中目的蛋白的精确定量，无须使用目的蛋白的特异性抗体；

(2)原材料使用少，该方法中商品化多肽及其抗体的使用量较低，如：V5多肽包被浓度为0.25μg/mL，V5单抗的使用浓度为0.5μg/mL，对于重组蛋白的定量分析，使用2.5μg的多肽抗体，便可对约80个样品进行定量分析，试剂盒组装成本低；

(3)分析了细胞上清中其它蛋白成分(FBS)对该检测方法准确性的影响，发现不同倍数稀释的FBS对标准曲线的建立无影响，重组蛋白所在溶剂中的FBS对V5多肽与其抗体的免疫结合无影响，同时也说明应用V5标签进行免疫反应的特异性较好，这一实验证明该方法对V5融合蛋白定量分析的准确性和可靠性；

(5)可以分析溶液中低至0.15ng/mL的目的蛋白，可以用于定量分析微量表达的融合蛋白；该试剂盒的检测范围是：0.1～2.0ng/mL，线性范围足以检测细胞表达上清中目的蛋白的含量。

附图说明

图1“棋盘滴定”法确定最佳的抗原抗体用量；

图2血清对标准曲线干扰的分析；

图3不同样品稀释倍数下的ELISA标准曲线；

图4ELISA标准曲线。

具体实施方式

本发明中所用到的包被缓冲液、清洗液、酶标反应板、封闭液、TMB底物、羊抗鼠IgG-HRP抗体等是本领域中ELISA法公知的试剂。可购买也可以自己配制。

实施例1

一、方法与步骤