[发明专利]禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白的单克隆抗体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子免疫学和病毒学交叉技术领域，具体涉及一种由杂交瘤细胞分泌的禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白（ENV）保守序列的单克隆抗体及其制备方法。

背景技术

禽网状内皮组织增生症（RE）是由禽网状内皮组织增生症病毒(REV) 引起的以网状细胞增生为主要特征的一组综合症(Witter R. L,1997)，包括急性网状细胞增生症、矮小综合征和淋巴组织及其它组织的慢性肿瘤增生性疾病，可引发为严重的生长抑制和免疫抑制。继禽马立克氏病和禽白血病之后，RE是迄今己经确定的禽类第三种传染性肿瘤病。

除已知火鸡、鸡、鸭、鹅、日本鹌鹑等家禽可感染不同的REV毒株外，还从野鸭、野火鸡以及野生鸟类中分离到该病毒。研究显示，目前，我国商品化鸡群REV抗体阳性率普遍偏高，有的地区更是高达80%。净化鸡群，减少REV对禽类生产的危害任重道远。

1、REV病毒的囊膜蛋白

REV基因组编码gag、pol和env三个结构蛋白。其中env基因编码的囊膜蛋白（ENV）包涵了REV病毒99%以上的抗原位点。世界各地学者对REV 研究发现，其env基因为该病毒的高变区域，极易发生突变。基于env表面蛋白基因gp90制备的单抗不能排除REV突变的影响，很大程度上影响了RE疾病的诊断精准率。以env基因中保守区域制备单抗，既保留了病毒绝大部分的抗原位点又排除了因基因变异带来的干扰，将有效的提高REV诊断的精准率。

2、禽网状内皮组织增生症的诊断方法研究现状

目前对禽网状内皮组织增生症的诊断，可通过临床剖检和组织病理学检查初步诊断，进一步确诊需要通过PCR、免疫组织化学、间接免疫荧光和ELISA等方法。PCR技术容易受到很多因素干扰，并可能出现假阳性和假阴性结果；目前我们使用的ELISA单克隆抗体试剂盒产于国外，价格昂贵，检测成本高，不利于大规模的鸡群检测和净化。免疫组织化学和间接免疫荧光方法检测REV、制备国产化抗体检测试剂盒均需要高特异性的单克隆抗体。研制出廉价高效且具有代表性的单克隆抗体，对净化集群，减少REV对养禽业带来的损失势在必行。

发明内容

针对于env基因编码的囊膜蛋白因基因突变带来的各种不便，本发明选取了env基因的相对保守区域共1200bp的基因片段，该片段表达的400个氨基酸包涵了REV病毒90%以上的抗原位点，这样既保留了病毒绝大部分的抗原位点又排除了因基因变异带来的干扰，利用含有该保守基因片段的env基因获得原核表达产物His-env融合蛋白，免疫Balb/C小鼠，经瘤细胞SP2/0与被免疫小鼠的脾细胞融合，筛选和克隆得到REV ENV蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体可有效地防止因REV突变对诊断效果的影响，为禽网状内皮组织增生症的诊断、预防提供科学基础和技术支撑。

本发明提供的由杂交瘤细胞分泌的REV囊膜蛋白的单克隆抗体；是通过如下具体步骤获得的：

根据REV标准毒株SNV株的前病毒基因组DNA env基因两端的一段序列作为引物。上游引物为5’-CCGGAATTCGCCATCCTACAGAAAACAAA-3’ 其基因序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物为5’-CGACTCGA- GAACAATATGAGCCCAAACA- 3’ 其基因序列如SEQ ID NO.3所示，并在引物中分别添加了EcoR I和Xhol I酶切位点。PCR扩增，DNA纯化试剂盒纯化PCR产物，利用pET-28a获得重组载体pET-28a-env重组质粒，将该重组质粒按常规方法转化入CaCl₂ 法制备的感受态细胞BL21，酶切法鉴定阳性克隆，阳性克隆送往测序公司测序，最终获得的env基因其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

将上述含有重组质粒的BL21菌接种于含氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基培养，使用0.4mmol/L IPTG诱导表达出了带有HIS标签的融合蛋白His-env，得到以包涵体形式表达His-env蛋白。通过透析得到的上清即为纯化完成的His-env融合蛋白。使用SDS-PAGE法检测纯化后的蛋白，其分子量为45KD。得到的蛋白经过Bradford 法测定蛋白含量，稀释到0.5mg/ml分装-20℃保存备用。