[发明专利]一种酶活性提高的青蒿紫穗槐二烯合酶突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种酶活性提高的青蒿紫穗槐二烯合酶突变体及其应用。 

背景技术

青蒿素是中国科学家首次从青蒿(Artemisia annua)中分离鉴定的一种含过氧桥的倍半萜内酯，是目前最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物。以青蒿素为基础的综合疗法已受到世界卫生组织和西方国家的确认和推荐。青蒿中青蒿素含量低(0.01-1％干重)，且受品种和地域性种植影响大，资源紧缺。 

在青蒿素生物合成中，倍半萜成分紫穗槐二烯(Amorphadiene，Amorpha-4，11-diene)由青蒿中的紫穗槐二烯合酶(amorpha-4，11-diene synthase；ADS)催化FPP环化形成，它是青蒿酸和青蒿素生物合成的共同前体。增加紫穗槐二烯的产量可以促进青蒿酸和青蒿素的合成和积累。人工全合成青蒿素工艺复杂、成本高。因此，目前世界上青蒿素原料主要依靠从野生和栽培青蒿中直接提取。 

青蒿素生物合成途径研究近年来取得许多进展，已经克隆了紫穗槐二烯合酶(ADS)、青蒿酸合成酶(CYP71AV1)和青蒿醛还原酶Dbr2。科学家们利用代谢工程技术尝试通过微生物发酵合成青蒿素前体青蒿酸，然后通过有机半合成生产青蒿素，以降低青蒿素的生产成本。2006年，Jay Keasling对酵母菌进行了遗传工程改造，使之产生出高水平的青蒿酸。目前认为，利用微生物生产青蒿酸是一个切实可行的方法，可以降低青蒿素的生产成本。另外，也可以通过转基因植物过量表达青蒿素生物合成的相关基因，以期提高代谢产物的含量。 

发酵工程菌种的遗传改造需要将青蒿酸生物合成途径中的基因ADS和CYP701AV1整合到工程酵母或者工程细菌染色体中。并且，ADS的酶活性直接关系到青蒿酸的生物合成的产量。 

因此，如何有效地提高ADS的酶活性是本领域需要深入研究的。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种酶活性提高的青蒿紫穗槐二烯合酶突变体及其应用。 

在本发明的第一方面，提供一种突变型紫穗槐二烯合酶，其对应于SEQ IDNO：2(野生型)氨基酸序列的第399位由苏氨酸突变为丝氨酸。 

在另一优选例中，该蛋白是： 

(a)具有SEQ ID NO：3(突变型)所示的氨基酸序列的蛋白；或 

(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸且保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且该蛋白的氨基酸序列中对应于SEQ ID NO：3第399位位置的氨基酸为丝氨酸。 

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组： 

(i)编码所述的突变型紫穗槐二烯合酶蛋白的多核苷酸；或 

(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。 

在另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽。 

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。 

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。 

在另一优选例中，所述的宿主细胞是酵母、细菌或植物细胞。更优选地，所述的宿主细胞是大肠杆菌。 

在本发明的另一方面，提供一种生产突变型紫穗槐二烯合酶的方法，包括步骤： 

(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和 

(2)从培养物中分离突变型紫穗槐二烯合酶。 

在本发明的另一方面，提供所述的突变型紫穗槐二烯合酶的用途，用于生产紫穗槐二烯和/或青蒿酸。 

在本发明的另一方面，提供一种生产紫穗槐二烯的方法，所述的方法包括：利用所述的突变型紫穗槐二烯合酶催化法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate，FPP)环化，从而获得紫穗槐二烯。 

在另一优选例中，所述的突变型紫穗槐二烯合酶催化FPP环化在胞内或胞外进行。 

在另一优选例中，所述的突变型紫穗槐二烯合酶催化法尼基焦磷酸环化在胞内进行，包括步骤：将所述的突变型紫穗槐二烯合酶的编码基因转化入宿主细胞，培养该细胞，从而生产紫穗槐二烯。