[发明专利]一种用于富集金黄色葡萄球菌的人IgG免疫磁珠的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫磁珠的制备方法及应用，具体涉及一种用于富集金黄色葡萄球菌的人IgG免疫磁珠的制备方法及应用，该制备方法用于分离致病性金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），包括金黄色葡萄球菌免疫磁珠的制备方法和应用方法，属于病原菌分离技术领域。

背景技术

免疫磁珠分离技术（Immunomagnetic bead-based separation,IMS）是近年来发展起来的一项新的免疫学技术。包裹有一定复合有机材料的微小磁珠在一定条件下既可结合蛋白质抗体成为抗体一磁珠二联体，将其加入经过前处理的样品中，磁珠上的特异性抗体可以和相应的抗原结合从而形成抗原一抗体一磁珠复合物（免疫磁珠，Immunomagnetic bead, IMB），这种复合物在磁力作用下，发生力学移动，使之与样品中的其它物质分离，而达到分离特定抗原的目的。免疫磁珠（IMB）是一个平台，凡是利用抗原抗体结合原理进行工作的领域都可以应用，并且已在医学和生物学的骨髓移植、分离干细胞、细胞器、癌细胞、激素、病原菌等方面取得了显著成绩。近年来IMB 以其高度的敏感性和特异性被广泛应用于食品、水、生物样品、环境等标本中病原微生物的分离和检测工作中，显示出良好的开发应用前景。

在分离致病性微生物方面，IMB可有效地收集、浓缩大量样品中的少量病原微生物。IMB对目的菌的富集具有高分离率、高特异性、高稳定性、无污染、无毒性、操作简便的特点。使用该方法样品用量少且不会伤及细菌，较之常规检验法相比，更高效、更敏感。该方法省去了常规方法中的预富集培养步骤，直接对致病菌进行分离，在2-6h内即可完成。此外，由于IMB特异性高，且能够识别性质极为相近的菌株，可以有效的区分致病性与非致病性菌株，从而减少漏检，显著地提高了分离准确率，减少了假阳性的出现。

近年来，免疫磁珠技术对食源性致病菌分离的研究集中于沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单增李斯特氏菌、副溶血弧菌等。根据常规免疫磁珠的制备原理，对于上述致病菌的免疫磁珠制备较繁琐，首先要制备这些菌种的单克隆抗体或多克隆抗体，然后将抗体与磁珠偶联，从而对菌株进行分离。因此，免疫磁珠的分离效果（准确度和灵敏度）直接受到抗体纯度的影响。本发明提及的人IgG免疫磁珠制备的原理是金黄色葡萄球菌细胞表面一种特有的蛋白质??-金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA），它具有与人IgG的Fc片段特异性结合的能力，每个SPA分子可以同时结合2个人IgG分子，将人IgG与磁珠偶联制成免疫磁珠，便可以用于分离金黄色葡萄球菌。人IgG分子的制备及纯化的技术现已成熟，市场上可以买到低价位，高纯度的人IgG标准品，为高质量低成本的人IgG免疫磁珠制备提供了条件。

目前，利用 SPA分子与人IgG特异性结合的原理分离人IgG的方法已相对成熟，而利用人IgG免疫磁珠分离金黄色葡萄球菌的研究仅处于初步阶段，对磁珠的制备和用于金葡菌的分离等条件的优化没有进行详细的研究，磁珠的稳定性和富集能力还不高。本发明利用此原理对用于金黄色葡萄球菌富集的人IgG免疫磁珠的制备工艺及富集应用条件进行了优化，大大提高了对金黄色葡萄球菌的富集能力和检测灵敏度，同时凭借其免疫磁珠自身的快速方便、不需要大型检测仪器、价格低廉的特点运用于食品、饲料、医疗环境和自然环境中金黄色葡萄球菌的分离与富集，可以进一步提高快速检测金黄色葡萄球菌效率。

发明内容

本发明的目的是为了弥补现有金葡菌检测技术存在的不足，提供一种用于富集金黄色葡菌球菌的人IgG免疫磁珠的制备方法及应用。磁珠经过适量活化剂（EDC-NHS组合）处理后与人IgG在合适的条件下进行偶联，制成人IgG免疫磁珠，将人IgG免疫磁珠加入待测经过前处理的样品中，在一定的条件下捕获金黄色葡萄球菌。

 为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案是：该用于富集金黄色葡菌球菌的人IgG免疫磁珠的制备方法是以磁珠为载体，偶联人IgG，制备成能够富集金黄色葡萄球菌的免疫磁珠；

一种用于富集金黄色葡萄球菌的人IgG免疫磁珠的制备方法，该方法以磁珠为载体，偶联人IgG，制备成能够富集金黄色葡萄球菌的免疫磁珠；

具体方法是：

（1）活化：取磁珠放入离心管中，加入活化缓冲液洗涤磁珠，反复三次，每次间隔3~5分钟，除去活化缓冲液后加入活化剂EDC和NHS各200μL，混匀，将磁珠于22~25℃条件下震荡孵育30～60分钟，将磁珠进行活化；