[发明专利]一种犬重组干扰素α及制备方法

权利要求书

1. 一种犬重组干扰素α，其特征在于：将犬干扰素α基因与表达载体pBV220进行连接。

2. 权利要求1所述犬重组干扰素α的基因，为以下序列：

ATG TGC CAT CTG CCG GAC ACC CAT GGC CTG CGT AAT TGG CGT GTG CTG ACG CTG CTG GGC   60

CAG ATG CGT CGT CTG AGC GCG GGT AGC TGC GAC CAT TAT ACC AAC GAT TTT GCG TTC CCG   120

AAA GAG CTG TTT GAT GGT CAA CGT CTG CAA GAA GCC CAG GCG CTG AGC GTG GTG CAT GTG   180

ATG ACC CAG AAA GTG TTT CAC CTG TTT TGC CCG GAT ACG AGC AGC GCG CCA TGG AAT ATG   240

ACC CTG CTG GAA GAA CTG TGC AGC GGC CTG AGC GAA CAG CTG GAT GAT CTG GAA GCG TGC   300

CCA CTG CAG GAA GCC GGT CTG GCG GAA ACC CCG CTG ATG CAT GAA GAT AGC ACC CTG CGC   360

ACC TAC TTT CAG CGC ATT AGC CTG TAT CTG CAG GAC CGT AAC CAT AGC CCG TGC GCG TGG   420

GAA ATG GTG CGT GCG GAA ATT GGC CGT AGC TTT TTC AGC AGC ACG ATC CTG CAA GAG CGT   480

ATT CGT CGT GGC AAA TAA                                                           498。

3. 权利要求1所述的犬重组干扰素α的制备方法，包括以下步骤：

1）编码犬重组干扰素α基因的获得 

利用CaIFN-α基因序列合成权利要求2所述的目的基因片段；

将上述基因片段与大肠杆菌温度诱导型载体（pBV220）进行重组；

用限制性内切酶(EcoRⅠ和SalⅠ)消化酶切表达载体，然后进行琼脂糖凝胶电泳切下目的DNA带，以外源目的DNA和载体DNA5:1的末端比例，用T4 DNA连接酶进行粘性末端定向连接，得重组目的基因片段；

2）E.coli BL21工程菌的获得

取37℃振荡培养过夜的E.coli BL21菌种，接种于LB培养基中，37℃振荡培养2-3小时；冰浴10min，4℃4000r/min离心10min收集菌体，用预冷的100mMCaCl₂溶液悬浮细胞，离心收集细胞，再用预冷的100mM CaCl₂溶液悬浮细胞，得到E.coli BL21感受态细胞；

将重组目的基因片段与100μl E.coli BL21感受态细胞混匀，冰浴30min，42℃水浴90s，再冰浴2min，加入0.5mlLB培养基37℃培养1小时后涂布于含100μg/mlAmpicillin的LB琼脂板，37℃培养过夜；挑取转化子接种于含Ampicillin的LB液体培养基中，37℃振荡过夜；收集菌体，得E.coli BL21工程菌；

3）发酵表达

按1％接种量将工程菌接种于200ml LB培养液中，30℃振荡培养过夜；按5％接种于1L LB培养液中，转二代30℃培养至OD值为0.6时，按10％接种于发酵罐中，30℃培养至OD为1-2时，快速升温至42℃，菌体表达，培养4-5小时，4000r/min离心30min，收集表达菌体；

4）菌体破碎

将上述菌体冰浴条件下超声破碎：频率为20kHz，破碎时间为5s，间隔时间为5s，连续30min；10000r/min离心15min，收集沉淀，得包涵体；将包涵体用4mol/L尿素，pH=8.5按1:5溶解，得包涵体悬浮液；

5）犬重组干扰素的变性

将上述包涵体悬浮液10000r/min离心15min，收集沉淀；将沉淀按1:5溶于7mol/L盐酸胍中，混合均匀，裂解作用2-3小时，得到裂解液；

6）犬重组干扰素的复性

将裂解液用2.5mol/L盐酸胍稀释后，按1:8悬浮0.15mol/L硼酸溶液中，4℃作用18h，得到复性液；

7）犬重组干扰素α的纯化 

上述复性液经0.45μm滤膜过滤，上载疏水层析柱和分子筛层析柱进行纯化；

疏水层析（hydrophobic interaction chromatography HIC）：疏水层析柱预先用（50mmol/L PB、1.5mol/L（NH₄）₂SO₄  pH7.8）液体平衡，用（50mmol/L PB、 1mol/L（NH₄）₂SO₄  pH7.8）洗脱，用（0.5mol/L NaOH）洗脱以再生层析柱，得到纯化的重组犬干扰素α样品；

分子筛层析（Sephacryl-S-100）：将上述纯化样品上载分子筛层析柱（Sephacryl-S-100），预先用（20mmol/L PB、0.85％NaCl  pH7.4）平衡层析柱；样品上载后用（20mmol/L PB、0.85％NaCl  pH7.4）洗脱，用（0.1mol/L NaOH）洗脱以再生层析柱，得到犬重组干扰素α样品。