[发明专利]一种酪蛋白活性单肽及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉发酵乳制备的技术领域，具体涉及从酪蛋白酶解液分离得到的具有具有提高发酵液中多糖含量的生物活性单肽及其应用。

背景技术

发酵乳是指在保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的作用下，使用添加 ( 或不添加 )乳粉( 全脂或脱脂)的乳进行乳酸发酵而得到的凝固乳制品，最终产品中必须含有大量的活菌。乳酸菌的发酵作用可以使乳白蛋白变成微细的凝乳粒，易于消化吸收，发酵过程中乳酸菌可以产生机体营养所必需的维生素、烟酸和叶。发酵乳除了保留了牛奶的全部营养外,其与鲜奶最显著的差异就是在于它还含有大量的乳酸及易于人体肠道健康的活性乳酸菌。

乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生长代谢过程中形成的位于细胞壁外的粘液多糖或荚膜多糖，属于微生物胞外多糖的一种。乳酸菌胞外多糖对于发酵乳制品形成良好的质构特征起着十分重要的作用，由于乳酸菌保外多糖作为生物高分子的特性而能改善产品的流变学特性，增强产品的稳定性和持水能力，使有关产品生产中不添加或少添加增稠剂、乳化剂等添加物，并赋予产品良好的口感和风味。此外研究发现，乳酸菌胞外多糖还具有突出的生理功能，如抗肿瘤、调理肠道、免疫调节、抗致突变、细胞保护和降低血清胆固醇等。

因此，通过在发酵乳中添加酪蛋白生物活性肽，有效地促进发酵乳发酵过程中胞外多糖的分泌和提高发酵液中多糖含量，对发酵乳行业具有重大的经济价值和现实意义。

发明内容

本发明提供一种有牛乳来源的、高安全性的、具有可产业化的酪蛋白活性单肽及其制备方法与应用。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种酪蛋白活性单肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）在50℃～55℃，pH 6.0-7.5的条件下加入木瓜蛋白酶对酪蛋白进行酶解，得酶解液；

（2）当水解度达到9％～10％时，90～95℃加热15～20min灭酶，终止酶解反应以控制生物活性肽的分子量；

（3）将灭酶活的酶解液依次通过膜分离、大孔树脂、凝胶色谱、反相高效液相进行分离纯化，即得所述生物活性肽。

上述的制备方法中，步骤（3）中将灭酶活的酶解液在4℃下以6000 g离心20分钟，将上清液经超滤，取分子量小于3000道尔顿的组分，采用大孔树脂NKA-II, 收集10-20%（w/w）乙醇洗脱液，接着采用Sephadex G-25,流动相为去离子水，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集；经Sephadex G-25分离得到的活性的组分再经C₁₈高效液相色谱分离纯化，分离条件为：5-40%乙腈和95-60%去离子水梯度洗脱，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集。

由上述制备方法制得的具有提高发酵液中多糖含量的酪蛋白活性单肽。

上述制得的酪蛋白活性单肽，通过液相色谱-电喷雾串联质谱测定其分子量为801.4道尔顿，该活性单肽氨基酸序列为：Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Asn-Leu。

上述酪蛋白活性单肽的应用，具体是将酪蛋白活性单肽与甘油混合应用于发酵乳发酵中，提高发酵液中多糖含量。所述应用中，以发酵乳总重计，酪蛋白活性单肽的添加量为0.001%-0.1%；甘油添加量为0.1%-2%。

与现有技术相比，本发明采用了以上技术方案，具有如下优点和效果：

1、本发明通过对酪蛋白酶解液的进一步分离、纯化得到了活性肽NPSKENL，该活性肽与甘油共同添加到发酵乳中，具有明显提高发酵乳中多糖含量作用。

2、本发明分离纯化所得的生物活性肽是从酪蛋白中分离得到的乳源性肽，可以安全的添加的到酸乳中。

附图说明  

图1为实施方式中Sephadex G-25对酪蛋白酶解液的初步分离图。

图2为实施方式中RP-HPLC对生物活性肽的分离纯化图。

图3为实施方式中添加生物活性单肽和甘油制备的发酵乳与空白对照中多糖含量的变化曲线。

具体实施方案

下面结合附图和实施例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。

实施例1：利用酪蛋白酶解液生产具有提高发酵液中多糖含量的生物活性单肽

1、 可控酶解：在50℃，pH 6.0的条件下加入木瓜蛋白酶对酪蛋白进行酶解，得酶解液。

2、 酶解液灭酶：90℃加热15min灭酶，终止酶解反应。

3、将灭酶活的酶解液离心（6000 x g，4℃）20分钟，将上清液经超滤（取分子量小