[发明专利]毕赤酵母表达重组人白介素11的生产方法

说明书

本申请是2004年11月25日提交的、申请号为200410089088.5、发明名称为“毕赤酵母表达重组人白介素11的生产方法”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及应用重组DNA技术生产基因工程蛋白药物技术，具体来说涉及一种从表达重组人白细胞介素11(rhIL-11)的毕赤酵母工程菌高密度发酵液中大规模纯化rhIL-11的方法。

背景技术

人白细胞介素11(human Interleukin 11，hIL-11)是与许多造血细胞相互作用的细胞因子，最早是从IL-1a刺激的哺乳动物骨髓细胞系PU-34的条件培养基中被鉴别的活性物质，可长期维持培养的血细胞的生存，随后从人胚胎成纤维细胞系中克隆到hIL-11cDNA。天然的hIL-11成熟蛋白含178个氨基酸，分子量19Kd；不含半胱氨酸，因而缺少二硫键，但蛋白的结构却相当稳定；没有糖基化修饰；富含脯氨酸(12％)，亮氨酸(23％)及正电荷残基(14％)，等电点为11.7。

hIL-11是由多种细胞产生并与多种细胞作用的细胞因子。rhIL-11可与其它因子协同作用刺激人的粒细胞，红细胞及巨核细胞的前体细胞生长，最终导致血小板数量的增加。除了造血细胞，rhIL-11还作用于其它细胞，具有促进消化道上皮损伤的恢复、调节脂肪细胞分化等多种生物活性(Du X X，Williams D A.Review of molecular，cell biology，and clinic use.Blood，1997，89(11)：3897-3908；Reynolds CH.Clinical efficacy of rhIL-11，Oncology(Huntingt)，2000，14(9Suppl 8)：32-40)。

1997年，美国Genetic Institute公司(GI)生产的rhIL-11获准上市，用于防止化疗引起的再生性血小板减少症(Kaye JA et a1.FDA licensure of NEUMEGA to prevent severe chemotherapy-induced thrombocytopenia，Stem Cells，1998，16(Suppl 2)：207-223；Rust DM，Wood LS，Battiato LA et al.Oprelvekin：an alternative treatment for thrombocytopenia，Clin J Oncol Nurs，1999，3(2)：57-62)。GI于1993年获得hIL-11基因(专利号US5215895)，1997年补充了该专利(专利号US5700664)，1998年获得生产方法发明专利(专利号US5760189)，这些专利都在美国申请。GI采用的是大肠杆菌融合表达生产方法。但这种系统存在以下缺点：(1)表达量不高，(2)生产成本过高，(3)蛋白纯化工序复杂。毕赤酵母是近年来发展起来的一种外源蛋白表达系统(Cereghino JL，Cregg JM.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris.FEMS Microbiol Rev，2000，24(1)：45-66)。它既具有大肠杆菌系统操作简单的优点，又对重组蛋白有一定的折叠和加工能力。本专利申请人曾提出了用甲醇酵母生产重组人白细胞介素11的方法(申请号：99118279.0)，可以极其方便的获得大量具有生物学活性的rhIL-11。但是该方法需要将发酵液离心后通过超滤等方法进行浓缩，去除发酵液中的杂质，降低电导，然后通过离子交换层析，疏水层析及凝胶层析的顺序组合来纯化蛋白，工序比较复杂，经离子交换层析后，杂蛋白和内毒素含量仍然比较高，不利于后续纯化。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种毕赤酵母表达重组人白介素11的生产方法，该方法采用了一般大规模蛋白纯化很少使用的反相层析方法，用来代替常用的超滤浓缩和离子交换层析两个步骤。采用本发明的方法，既可以减少纯化工序，也可以提高纯化效率和收率，更有利于杂蛋白和色素，内毒素等杂质的去除。