[发明专利]一种淋病奈瑟菌免疫阻遏突变基因Δrmp及突变方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学微生物学领域，具体涉及一种淋病奈瑟菌免疫阻遏基因突变方法。

背景技术

淋病奈瑟菌（Neisseriagonorrhoeae）的天然宿主是人类，感染后导致性传播疾病淋病，可引起一系列病变，包括局部感染（如尿道炎、副睾炎、宫颈炎，输卵管炎等）和全身播散性感染。输卵管、盆腔等部位的病变可导致不孕症或宫外孕等严重后遗症。淋病患者还大大增加了艾滋病的发病机会。淋病发病率高，全球每年新发病例约6200万。越来越严重的淋病奈瑟菌耐药性现象给淋病治疗带来了越来越大的困难。因此，研制有效的疫苗是淋病防制工作中的重点方向之一。

淋病奈瑟菌疫苗研制历经艰难，二十世纪七十年代全细胞疫苗的人体试验遭遇失败，研究的重点开始转向亚单位疫苗和基因疫苗等新型疫苗。菌毛是第一个被纯化的淋病奈瑟菌亚单位成分，尽管纯化后的菌毛能够刺激机体产生较高滴度的抗体，但是由于菌毛表面一些表位变异程度高，这些抗体并不具有显著的免疫保护作用。同样由于高度变异的原因，另一类重要粘附因子Opa蛋白在淋病疫苗研制中也受到了限制。孔蛋白是持续表达在淋病奈瑟菌表面的Ⅰ型外膜蛋白，具有免疫原性强、抗原相对保守等特点。90年代初期曾用覆盖多数血清型的porin疫苗进行动物免疫实验，效果并不十分理想。分析其原因，发现从淋病奈瑟菌细胞中提取的porin疫苗中污染了大量Rmp蛋白，后者是很好的免疫原，其免疫原性比porin高，能刺激机体产生补体结合抗体，但这些抗体不但没有抗菌作用，相反能对porin抗体的抗菌活性产生拮抗作用，甚至能增强淋病奈瑟菌的感染性。随着基因工程技术的迅速发展，用基因工程技术表达淋病奈瑟菌抗原成为研制淋病疫苗的重要方向。人们已经成功表达了多种淋病奈瑟菌抗原，如Porin、NspA、TbpA、TbpB、LOS等，用蛋白质相关技术进行纯化和复性，配合一定佐剂免疫小鼠，发现在小鼠体内均可以诱导产生特异性保护抗体。

从目前的淋病奈瑟菌疫苗的研究现状分析，用单一一种抗原的淋病奈瑟菌疫苗完全预防淋病奈瑟菌感染是非常困难的。尽管这种疫苗可以产生一定的保护力，但是，如果这种接种只是使淋病奈瑟菌感染转为无症状型，感染者因而不就医，那反而会增加淋病奈瑟菌的传播。因此，含有更多甚至全部淋病奈瑟菌保护性抗原的疫苗是最理想的淋病疫苗候选。

发明内容

野生型淋病奈瑟菌中含有免疫阻遏基因rmp，该基因的产物蛋白Rmp可诱导机体产生对抗保护性抗体的有害抗体。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种突变rmp，以及一种淋病奈瑟菌免疫阻遏基因突变方法，从而避免有害抗体产生的有效方法，解决了研制淋病奈瑟菌全细胞疫苗的瓶颈问题。

本发明所述的突变免疫阻遏基因Δrmp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明所述的突变免疫阻遏基因Δrmp通过以下方法获得：是以淋病奈瑟菌基因组DNA为模板，PCR扩增rmp基因，并连接到T载体pMD19中，以连接产物pMD19rmp为模板，扩增包含rmp基因下游侧翼区、pMD19载体骨架和rmp基因上游侧翼区的线性DNA片段，与相同酶切处理的卡那霉素抗性基因Kanr连接，得到的突变基因Δrmp。

本发明所述突变方法，包括步骤如下：

（1）rmp基因的克隆：以淋病奈瑟菌基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列为引物通过PCR扩增出序列如SEQ ID NO.3所示的淋病奈瑟菌rmp基因；

（2）rmp上下游两侧侧翼区的扩增：以上述（1）中扩增的rmp基因与pMD19-T载体的连接产物pMD19rmp为模板，扩增包含rmp基因两侧侧翼区的线性片段；扩增包含rmp基因两侧侧翼区线性片段的正反向引物序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，扩增得到序列如SEQ ID NO.6所示的包含rmp基因两侧侧翼区的线性片段；

（3）以质粒pET-28a(+)为模板，扩增Kanr基因序列

其中引物序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，经PCR扩增得到的 Kanr基因序列如SEQ ID NO.9所示；

（4）rmp基因的插入突变