[发明专利]一种转基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR检测方法

权利要求书

1.一种转基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR检测方法，其特征在于，该方法包括：利用Primer Premier V5.0软件进行巢式PCR的引物设计，用Oligo V6.22软件筛选出相互干扰最小的引物；

扩增所用的引物及扩增片段大小为：

第一轮PCR所用引物

引物名称：35S EF 序列（5'→3'）ATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCA

          35S ER 序列（5'→3'）TGTGGTGTTTGTGGCTCTGTCCTAA

扩增片段大小：454bp；

第二轮PCR所用引物

引物名称：35S IF 序列（5'→3'）GCTCCTACAAATGCCATCATTGC

          35S IR 序列（5'→3'）GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC

扩增片段大小：195bp；

第一轮PCR反应体系及反应程序为：在PCR反应体系中，加DNA模板2μL（50ng）；反应程序为94℃预变性10min、94℃变性40s、58℃退火40s、72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5 min，4℃保存；

第二轮PCR反应体系及反应程序为：在第二轮PCR反应体系中，加第一轮PCR扩增产物2uL；反应程序为94℃预变性10min、94℃变性40s、56℃退火40s、72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5 min，4℃保存待测；

两轮PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，并样品分析，即可。

2.根据权利要求1所述的一种转基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR检测方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶浓度为2%，胶中溴化乙锭浓度为0.5μg/mL，电泳条件以10V/cm电压，电泳时间1h。

3.根据权利要求1所述的一种转基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR检测方法，其特征在于，样品分析为：第二轮PCR扩增片段大小与预期片段大小一致，表明样品中检测出花椰菜花斑病毒CaMV35S启动子，即呈阳性；反之，则未检出花椰菜花斑病毒CaMV35S启动子，即呈阴性。

4.根据权利要求1所述的一种转基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR检测方法，其特征在于，第一轮PCR产物是否能观察到与预期片段大小一致的DNA片段，均不作为判断结果；而仅以第二轮PCR产物的观察结果作为最后判断结果。