[发明专利]一种转基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种利用巢式PCR技术针对转基因作物中花椰菜花斑病毒CaMV35S启动子的检测方法。

背景技术

目前，全球转基因作物商品化生产迅猛发展。自1996年首次商业性种植以来，转基因作物以其大大减少田间劳作、降低生产成本、缓解环境恶化等优越性，迅速被广大农民接受，种植面积不断扩大。转基因作物给人们带来巨大经济效益的同时，其潜在的生态安全和食品安全问题，也日益受到人们的关注。现在转基因技术仍处于发展过程中，国际上生物安全方面的评估体系尚不成熟，现有的知识不足以评估转基因作物的利益与风险。鉴于此，国际上大多数国家制定了相应的法律法规，对转基因作物及产品进行监管，如欧盟各国、日本、韩国等均制定了强制性标识制度；我国于2001年、2002年先后颁布了《农业转基因生物安全管理条例》、《农业转基因生物标识管理办法》，启动了农业转基因生物的监管机制。我国政府规定了凡是列入标识管理目录并用于销售的农作物转基因作物，应当加以标识。因此，必须对转基因作物及产品进行有效的检测。  

转基因作物及产品检测主要采用蛋白检测方法和DNA检测方法。DNA检测方法中，主要采用聚合酶链式反应（PCR），该技术又分为定性PCR检测和定量PCR检测。而巢式PCR检测属于定性PCR检测，是在普通PCR基础上发展起来的一种新技术，其原理是设计两对引物，其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上，通过二次PCR反应对某个基因进行检测。巢氏PCR以其特异性和灵敏性已广泛应用于许多检测领域，一般来说，巢式PCR具有高度的特异性，其结果一般不需再用其他方法来验证。

在利用基因工程技术将一个外源基因整合进入植物基因组中时，外源基因必须配备一个启动子。花椰菜花斑病毒CaMV35S启动子是转基因作物中一种广谱性的外源启动子，如玉米、棉花、大豆、番茄等大约有85-90%的转基因作物使用了该启动子。CaMV35S启动子其保守序列相当稳定，是转基因检测的最佳靶点。通过巢式PCR检测CaMV35S启动子可高效、灵敏、准确地检测农作物及产品中是否具有转基因成分。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR检测方法，用以检测转基因作物中花椰菜花斑病毒CaMV35S启动子，本检测方法具有高效、灵敏、准确等优点，可避免出现“假阴性”结果，能切实解决转基因作物的检测技术难题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种转基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR检测方法，该方法包括：利用Primer Premier V5.0软件进行巢式PCR的引物设计，用Oligo V6.22软件筛选出相互干扰最小的引物；

扩增所用的引物及扩增片段大小为：

第一轮PCR所用引物

引物名称：35S EF 序列（5'→3'）ATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCA

              35S ER 序列（5'→3'）TGTGGTGTTTGTGGCTCTGTCCTAA

扩增片段大小：454bp

第二轮PCR所用引物

引物名称：35S IF 序列（5'→3'）GCTCCTACAAATGCCATCATTGC

          35S IR 序列（5'→3'）GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC

扩增片段大小：195bp；

第一轮PCR反应体系及反应程序为：在PCR反应体系中，加DNA模板2μL（50ng）；反应程序为94℃预变性10min、94℃变性40s、58℃退火40s、72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5 min，4℃保存；

第二轮PCR反应体系及反应程序为：在第二轮PCR反应体系中，加第一轮PCR扩增产物2uL；反应程序为94℃预变性10min、94℃变性40s、56℃退火40s、72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5 min，4℃保存待测；

两轮PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，并样品分析，即可。

所述的一种转基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR检测方法，所述的琼脂糖凝胶浓度为2%，胶中溴化乙锭浓度为0.5μg/mL，电泳条件以10V/cm电压，电泳时间1h。