[发明专利]一种同序引物置换的核酸扩增技术

权利要求书

1.一种同序引物置换的核酸扩增技术，其特征在于，其步骤包括：(1)在靶特异引物5’上游连接人工序列，形成嵌合引物；(2)以所述嵌合引物扩增靶模板产生两端带人工序列的二次模板；(3)用65％-75％同序的人工序列作为置换引物扩增二次模板。

2.按照权利要求1所述的同序引物置换的核酸扩增技术，其特征在于，其为单侧靶特异引物置换的核酸扩增技术，其置换引物设计公式：以X_n代表一侧直接靶特异引物一段碱基，中间X_T确定为应同序的碱基，则Y_n代表另一侧靶特异引物序列碱基，以X_n、X_T、Y_n代表任何A/G/C/T，A为腺嘌呤碱基；

直接靶特异序列引物X：5’-X₁X₂…X₅X_T……X_Tx_AX_AX_n-3’，

嵌合引物Y_s：5’-y_ny_n-1…y_n-5X_T……X_T(A)AX_n+AAY₁Y₂……Y_n-1Y_n-3’，小写y代表Y互补碱基，

置换引物S_y：5’-y_ny_n-1…y_n-5X_T……X_T(A)AX_n-3’，        X_A变异为A。

置换引物∶嵌合引物均按2-20∶1预先配好。

3.按照权利要求1所述的同序引物置换的核酸扩增技术，其特征在于，其为双侧靶特异引物置换的核酸扩增方法，其多重靶引物低浓度而过量扩增引物单一化策略，特别适合多重PCR检测。其置换引物设计公式：以X_1-n代表一侧直接靶特异引物序列碱基，则Y_1-n代表另一侧靶特异引物序列碱基，S_1-n为一对70％同序的功能序列碱基，A为腺嘌呤碱基。

一侧嵌合引物X_s：5’-S₁…S₆……S_n-1S_n+AAX₁X₂……X_n-1X_n-3’，

一侧置换引物S_T：5’-S₁…S₆……S_n-1S_n-3’，

另一侧嵌合引物Y_s：

5’-y_ny_n-1…y_n-5S₆……S_n-AS_n+AAY₁Y₂……Y_n-1Y_n-3’，小写y代表Y互补碱基，

另一侧置换引物S_Y：5’-y_ny_n-1…y_n-5S₆……S_n-AS_n-3’，       S_n-1变异为A。

置换引物∶嵌合引物均按5-50∶1预先配好。

4.按照权利要求1所述的同序引物置换的核酸扩增技术，其特征在于，所述扩增反应体系加入PCR增强剂1％-2％二甲基甲酰胺DMF。

5.按照权利要求1所述的同序引物置换的核酸扩增技术，其特征在于，所述嵌合引物嵌合结头处尽可能地引入脱氧腺嘌呤dA碱基，以使嵌合引物聚合体非特异性扩增产物含尽可能多、密度更集中的dUTP碱基。