[发明专利]利用黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物转化技术领域，具体涉及一种利用黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷的方法。

背景技术

熊果苷是源于杜鹃花科熊果属植物熊果叶的一种成份。研究表明熊果苷具有抑制酪氨酸酶活性、镇咳、利尿、抗菌等生物活性。熊果苷能有效地与酪氨酸酶结合，使黑色素的合成减少，从而减少皮肤中色素沉积，是目前国内外常用于美白化妆品中的主要原料，国内外市场需求十分巨大。目前熊果苷的生产主要是通过化学合成，但是化学合成需要4～6步反应完成，合成成本高、污染大、副产物多。

生物转化是指通过培养微生物、植物细胞、植物组织，利用其体内的酶对外源底物进行结构修饰而获得有价值产物的一种技术。该技术与化学合成相比，具有无毒、无污染、低能耗、高效率、高选择性等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种成本低、无污染并且转化率高的利用黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷的方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

培养黄芩毛状根，利用培养后的黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷。

所述培养黄芩毛状根的培养基为改良MS培养基，该改良MS培养基包含大量元素、微量元素、铁盐和有机成分，pH为5.4～6.0；

所述大量元素包含950mg/L的KNO₃、42.5mg/L的KH₂PO₄、185mg/L的MgSO₄·7H₂O、220mg/L的CaCl₂·2H₂O和500mg/L的水解乳蛋白；

所述微量元素包含0.83mg/L的KI、6.2mg/L的H₃BO₃、22.3mg/L的MnSO₄·4H₂O、8.6mg/L的ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L的Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L的CuSO₄·5H₂O和0.025mg/L的CoCl₂；

所述铁盐包含18.65mg/L的Na₂·EDTA和13.9mg/L的FeSO₄·7H₂O；

所述有机成分包含100mg/L的肌醇、2mg/L的甘氨酸、0.1mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆醇和0.5mg/L的烟酸。

上述改良MS培养基通过改变现有MS培养基(1962年由Murashige，T.和Skoo-ge，F.二人设计的，故简称MS培养基。)的组成，更适合黄芩毛状根的生长。

所述培养黄芩毛状根的方法为：

1)将黄芩毛状根以4-5g/L接种于黄芩毛状根种子培养基中于100～150r/min下避光震荡培养18～20天得黄芩毛状根种子，培养的温度25～28℃，黄芩毛状根种子培养基为添加40-50g/L蔗糖的改良MS培养基；

2)将黄芩毛状根种子以4-5g/L接种于培养基中于100～150r/min下避光震荡培养20～30天，培养的温度为25～28℃，培养基为添加30-60g/L蔗糖、葡萄糖或其混合物和0.4mmol/L苯丙氨酸的改良MS培养基。加入一定量的蔗糖、葡萄糖和0.4mmol/L苯丙氨酸的作用在于促进黄芩毛状根快速生长，提高了黄芩毛状根转化合成熊果苷的能力，有利于节约生产成本，提高经济效益。

所述转化的时间为30～40h，转化时的温度为20～28℃。

所述对苯二酚在加入前用体积分数70％的乙醇水溶液进行溶解，溶解比例为每1-5mL乙醇水溶液溶解20mg对苯二酚。乙醇水溶液的作用在于降低加入对苯二酚的过程中黄芩毛状根染菌的机率，避免黄芩毛状根转化对苯二酚过程中染菌。

所述对苯二酚的加入量为每100mL黄芩毛状根的培养液中加入15～25mg。当每100mL培养液的加入量超过25mg时，对苯二酚抑制黄芩毛状根的生长。

与现有的熊果苷生产技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：