[发明专利]两种含不同CpG序列PCV2-ORF2基因疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因疫苗使用的佐剂和其制备方法，具体是两种含有14个CpG-ODN重复基序及18个CpG-ODN重复基序的PCV2ORF2基因核酸疫苗。

技术背景

基因疫苗(gene vaccine)是近年来随着基因治疗而发展起来的第三代疫苗。它是将编码某一特定保护性抗原蛋白的外源基因与真核表达载体进行重组后，直接导入动物体内，利用免疫原基因在宿主体内表达出抗原蛋白质引起机体的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。与常规疫苗相比，基因疫苗具有如下优点：免疫效果好；不散毒，无污染；保护性免疫持续时间长；方法简便、价格低廉；核酸疫苗具有相同的理化性质，为联合免疫提供了可能；便于贮藏和运输；不受个体已有的免疫反应(如母源抗体)的影响。

猪圆环病毒是一种小的、二十面体对称、无囊膜、共价闭合、单股环状DNA病毒，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原。根据PCV的致病性及全基因组序列，可分为两个血清型：PCV-1与PCV-2。PCV-2含有两个主要阅读框ORF1和OFR2。其中ORF2为702bp，编码233个氨基酸，是病毒的主要结构蛋白，具有良好的免疫原性，是构建重组疫苗的首选基因。

在核酸疫苗的免疫应答过程中，高效免疫增强剂的应用，能全面提高机体的整体免疫水平，增强抗病防御和免疫应答能力，提高疫苗保护率。其中，CpG-ODN(CpG寡聚脱氧核苷酸)的研究是其中的焦点。CpG序列已被证实能作为疫苗的高效免疫增强剂，使用得当能够大幅度提高疫苗的免疫保护率和机体的免疫水平。近来大量免疫学研究证实：含CpG序列的DNA分子具有以下免疫效果：(1)诱导B细胞增殖、分化、成熟和分泌免疫球蛋白；(2)抗诱生的细胞凋亡；(3)诱导单核细胞分泌IL-12及其他细胞因子；(4)活化自然杀伤(NK)细胞的裂解活性和干扰素(IFN-γ)分泌。但CpG-ODN具有种属特异性，本发明中的CpG-ODN都是经过实验证实对猪具有免疫增强作用的序列。

附图说明

图1：PCV2的ORF2基因的PCR扩增产物，其中条带1为DNA标准DL 2000，条带2、3、4、7、9为阳性PCR产物(ORF2)，条带5、6、8为阴性PCR产物。

图2：重组质粒pVAX1-ORF2的PCR鉴定，其中条带1为DNA标准DL 2000，条带2-5为从pVAX1-ORF2上PCR扩增出的ORF2片段，条带6为阳性对照(从PCV2病毒DNA上扩增出的ORF2片段)。

图3：免疫荧光检测结果，其中图A为pVAX1-ORF2-CpG(14CpG)转染组间接免疫荧光检测结果(100x放大)，图B为pVAX1-ORF2转染组间接免疫荧光检测结果(100x放大)，图C为pVAX1空载体转染组间接免疫荧光检测结果(100倍放大)。

图4：仔猪平均日增重记录结果

图5：猪体温检测结果图

图6：猪外周血抗体水平检测结果

图7：病理组织切片图，其中，左侧一列(A组)为PBS组，中间一列(B组)为空载体组，右侧一列(C组)为疫苗(14CpG)注射组。

图8：攻毒后组织病理变化。

发明内容

本发明的第一个目的足提供两种新的供猪免疫疫苗使用的CpG-ODN基序，可使DNA疫苗产生更有效的免疫反应。

本发明的第二个目的是提供本发明核酸疫苗的制备方法。

本发明CpG-ODN作为免疫增强剂的优越性：制备方法简单，易于保存和运输；质量易于控制，易规模化生产，成本低廉，易于保存和运输；安全性好。细胞因子是机体内本身存在的免疫调节分子，对人体无毒副作用，同时也受机体免疫调节网络的控制；易于构建和改造，利用分子生物学技术在基因水平可实现人们所期望的免疫应答强度和类型。

具体实施方式

本发明的佐剂的制备方法详述如下：

(1)人工合成不同的CpG-ODN基序

14个CpG-ODN重复基序：

(SEQ ID NO：1)

18个CpG-ODN重复基序：

(SEQ IDNO：2)

利用引物ORF2s、ORF2r扩增出PCV2SD1株的完整ORF2基因，序列如下：