[发明专利]改进的β-葡萄糖苷酶基因及其重组酶的制备

权利要求书

1.改进的β-葡萄糖苷酶基因，其特征在于核苷酸序列bglII如SEQ ID NO.1所述。

2.包含权利要求1所述核苷酸序列的重组质粒。

3.包含权利要求1所述核苷酸序列的重组质粒pPICZα-bglII。

4.包含SEQ ID NO.1所述β-葡萄糖苷酶基因的重组质粒制备方法，其特征在于步骤为：

bgl II的合成：设计一组98条寡核苷酸，所述98条寡核苷酸序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.99所述；黑曲霉的β-葡萄糖苷酶基因bgl II的获得，采取两步PCR扩增技术；第一步，反应体系50 μL：5 μL的全部98条寡核苷酸引物100 nM，4 μL dNTP Mixture，各2.5 mM，5 μL 10 × PCR Buffer，2.5 U Ex Taq，加水补足50 μL，反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，59℃退火3 min，72℃ 1 min，30个循环，72℃延伸10 min；第二步，PCR扩增基因bgl II，反应体系50 μL：包含上面的反应物2 μL，引物SEQ ID NO.2，10 μM 1 μL，引物SEQ ID NO.99，10 μM 1 μL， dNTP Mixture，各2.5 mM，4 μL，5×PCR Buffer 10 μL，2.5 U Ex Taq，加水补足50μL，反应条件为: 94℃预变性5 min，94℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃ 3 min，30个循环，72℃延伸10 min；

重组质粒pPICZα-bglII的构建：将获得的改造后的基因bgl II和pPICZα-A分别用内切酶EcoR I、Sac II进行分步酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，宿主菌使用Top10F’的感受态细胞，涂布在LLB平板，LLB平板含25 μg/mL Zeocin，倒置平板过夜，挑选单菌落到5 mL液体LLB中，液体LLB中含25 μg /mL Zeocin，37℃，200 rpm 培养8 h，得到重组质粒pPICZα-bglII。

5.含有权利要求3所述重组质粒的宿主细胞为毕赤酵母。

6.利用含有权利要求1所述改进的β-葡萄糖苷酶基因宿主细胞制备重组酶的方法，其特征在于发酵培养基为：质量浓度为85%的H₃PO₄ 26.7 mL，CaSO₄·2H₂O 0.93 g，K₂SO₄ 18.2 g，MgSO₄·7H₂O 14.9 g，KOH 4.13 g，Glycerol 50 mL，100 mM K₂PO₄-KH₂PO₄缓冲液100 mL，加入超纯水至1L；PTM1 微量元素：CuSO₄·5H₂O 6.0 g，NaI 0.08 g，MnSO₄·H₂O 3.0 g，NaMoO₄·2H₂O 0.2g，H₃BO₃ 0.02 g，CoCl₂ 0.5 g，ZnCl₂ 20.0 g，FeSO₄·7H₂O 65.0 g，H₂SO₄ 5.0mL，加入超纯水至1L，用 0.22 μm 的滤膜过滤除菌；诱导表达β-葡萄糖苷酶的适宜条件为：发酵培养基的pH值6.0，发酵温度28-30℃，DO值在30%左右，并添加诱导量的PTM1，组氨酸和甲醇，诱导时间为108 h。